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酶联免疫吸附技术(ELISA)的操作要点
 质的试剂,良好的仪器和正确的操作是保证elisa 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操作因固相载体的形成不同而有所差异,国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA 各个操作步骤的注意要点,珠式、管式及磁性球ELSIA ,国外试剂均与特殊仪器配合应用,两者均有详细的使用说明,严格遵照规定操作,必能得出准确的结果。
 
1、 标本的采取和保存
 
可用作 ELISA 测定的标本十分广泛,体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液),有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外,其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、收缩后即可取得。除特殊情况外,在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA 中血浆和血清可同等应用。
 
血清标本可按常规方法采集,应注意避免溶血,红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质,以HRP 为标记的ELISA 测定中,溶血标本可能会增加非特异性显色。
 
2 试剂的准备
 
按ELISA试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。 ELISA 中用的蒸馏水或去离子水,包括用于洗涤的,应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。
 
3 加样
 
在 ELISA 中一般有3 次加样步聚,即加标本,加酶结合物,加底物。加样时应将所加物加在LEISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可溅出,不可产生气泡。
 
加标本一般用微量加样器,按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴,以免发生交叉污染,也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法 ELISA )需用稀释的血清,可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液,再在其中加入血清标本,然后在微型震荡器上震荡1 分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器,使加液过程迅速完成。
 
4 保温
 
在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应,即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间,这一保温过程称为温育(incubation) ,有人称之为孵育,在ELISA 中似不恰当。
 
ELISA 属固相免疫测定,抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例,加入板孔中的标本,其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会,只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程,因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA 反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有 43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度,也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA 方法作反应动力学研究时,实验表明,两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2 小时,产物的生成可达顶峰。为加速反应,可提高反应的温度,有些试验在43℃进行,但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底,在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜,以形成最多的沉淀。但因所需时间太长,在ELISA 中一般不予采用。
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