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细胞培养的注意事项
 养好细胞注意点
 
(一)冷冻管应如何解冻 
 
取出冷冻管后,须立即放入37 ℃ 水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管的爆裂。
 
(二)细胞冷冻管解冻培养时,DMSO如何处理
 
在细胞解冻之后,可直接离心去除DMSO,用新鲜的培养基悬浮后直接放入含有 新鲜培养基的培养角瓶中进行细胞培养,如此可避免解冻后细胞生长受到DMSO影响。
 
(三)可否使用与原先培养条件不同的培养基
 
每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基,若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活,不应该马上替换。
 
(四)可否使用与原先培养条件不同的血清种类
 
 血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生大的影响。来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。
 
(五)何谓 FBS,FCS,CS,HS
 
FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,两者都是指胎牛血清。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
 
(六)培养细胞时应使用 5% 或 10% CO2
 
一般培养基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作为 pH 的缓冲系统,而培养基中 NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的 CO2 浓度。理论当培养基中 NaHCO3 含量为每公升 3.7 g 时,细胞培养时应使用 10% CO2;当培养基中 NaHCO3 为每公升 1.5 g 时,则应使用 5% CO2 培养细胞。
 
(七)何时须更换培养基。培养基中是否须添加***。
 
视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上的更换时间,按时更换培养基即可。
 
一般正常培养状态下,培养基中可以添加***。 按1%体积分数加入双抗贮存液(青霉素+链霉素),使青霉素和链霉素的终浓度分别为100 U/mL和100 μ/mL。
 
(八)贴壁细胞传代时所使用的 trypsin-EDTA 浓度及相应处理
 
一般使用的 trypsin-EDTA 浓度为 0.25% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。**次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于 –20 ℃,避免反复冷冻解冻造成 trypsin 的活性降低,并可减少污染的机会.。
 
(九)将一般动物细胞离心下来,离心速率多少
 
回收动物细胞,其离心速率一般为 1 000 rpm,5~10 分钟,过高的转速,将造成细胞死亡。
 
(十)细胞的接种密度
 
依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的重要原因之一。
 
(十一)细胞冷冻培养基的成分及DMSO的等级
 
动物细胞冷冻保存时*常使用的冷冻培养基是含 5~10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和 90~95 % 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合。注意:由于 DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将 DMSO 直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。冷冻保存使用的 DMSO 等级,必须为 Tissue culture grade 的 DMSO ,其本身即为无菌状况,**次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中避光保存。
 
(十二)冷冻保存细胞的方法及冷冻细胞浓度
 
将贴壁细胞消化后离心收集,悬浮细胞直接离心收集,以含有DMSO完全培养基或胎牛血清的冻存液重悬细胞至终浓度约1x106/ml。。以每管1~2ml分装至冻存管中。用绝热材料包裹置-70摄氏度冰箱冷冻过夜。次日保存到液氮中。 
 
冷冻管内细胞数目一般为 1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以 5x106 cells/ml vial 为宜。
 
 
(十三)如何避免细胞污染
 
细胞污染的种类可分成**、**、霉菌、病毒等。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的*好方法。
 
(十四)支原体 (mycoplasma)污染的细胞, 对细胞培养有何影响
 
不能以肉眼观察出支原体污染异状。除极有经验的专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨。
 
支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数,代谢及研究任一数据。故进行实验前,必须确认细胞为 mycoplasma-free,实验结果的数据方有意义。
 
(十五)培养基保存于 4 ℃ 冰箱中,颜色会偏暗红色,且 pH 值会越来越偏碱性
 
培养基保存于 4 ℃ 冰箱中,培养基内的 CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性,而培养基中的酸碱指示剂 (通常为 phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果,将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤 CO2 ,以调整 pH 值。或酸碱调PH。
 
(十六)L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗?它在溶液中不稳定吗?
 
L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
 
(十七)什么培养基中可以省去加酚红?培养基中丙酮酸钠的作用是什么?
 
酚红在培养基中被用来作为 PH 值的指示剂:中性时为红色,酸性时为黄色,碱性时为紫色。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加有酚红的培养基。
 
丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源,尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源,但是,如果没有葡萄糖的话,细胞也可以代谢丙酮酸钠。
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