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VEGF ELISA试剂盒
VEGF ELISA试剂盒
日本IBL原装进口,货号:27171
日本IBL中国*代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务
前言说明
血管内皮生长因子(VEGF)是一种同型二聚体蛋白,zui初人们是从富含正常牛垂体滤泡星形蛋白细胞的基质中分离纯化得到,由各种血管组织分泌。后来人们发现VEGF与一种血管通透因子(VPF)相同, VPF是之前在富含肿瘤细胞系的基质中鉴别得到的,肿瘤细胞可以提高毛细血管的通透性。据报道,VEGF的活性包括促进内皮细胞的生长,促进血管的生成和提高毛细血管的通透性。VEGF是一种分子量为38.2kDa的同型二聚体,它由两条含165个氨基酸的多肽链组成。多数人肿瘤细胞都会分泌VEGF,包括:人肺腺癌、胰腺癌、肝癌、肾癌、纤维肉瘤、HL60早幼粒细胞性白血病、GS-9L神经胶质瘤和U937淋巴瘤细胞。一些正常的组织也会分泌VEGF,如:活化的巨噬细胞、角质化细胞、肝细胞、平滑肌细胞、间质细胞、胚胎成纤维细胞、支气管及脉络丛上皮细胞,肾小球内脏上皮及其系膜细胞。IBL公司的人VEGF ELISA试剂盒可用于人EDTA血浆和细胞培养上清中VEGF的定量检测。
实验原理
此试剂盒是一种夹心法的ELISA试剂盒,使用了两种高特异性的抗体。TMB作为显色剂,zui终溶液所显示的颜色强度与样品中VEGF的量成正比。
测定范围
15.63~1000pg/ml (*次温育:37℃下温育60min)
7.81~500pg/ml (*次温育:4℃下温育过夜)
预期用途
此试剂盒可用于人EDTA血浆和细胞培养液上清EGF的体外定量检测。此试剂可识别天然的和重组的VEGF。利用夹心法的酶联免疫吸附实验,采用用了高特异性的多克隆抗体和单克隆抗体。
试剂盒成分
1)  包被板:微孔中包被了抗人VEGF-1(16F1)的鼠IgG单克隆抗体,96孔。
2)  浓缩型酶标抗体:HRP标记的抗人VEGF-1兔IgG Fab片段,30倍浓缩,0.4ml
3)  标准品:内含重组的人VEGF 165,0.5ml×2
4)  EIA缓冲液:1%的BSA,含0.05%的吐温的PBS,30ml
5)  酶标抗体稀释液:内含的1%BSA、0.05%吐温20的PBS,12ml
6)  显色剂:TMB底物液,15ml
7)  终止液:1N的H2SO4,12ml
8)  浓缩洗涤液:内含0.05%吐温的磷酸缓冲液(40倍浓缩),50ml。
实验所需器材但试剂盒不提供


 

l         酶标仪(450nm)
l         带刻度的量筒与烧杯
l         孵箱(37℃±1℃)
l         吸水纸
l         冰箱(4℃)
l         试管
l         微量移液器和取样吸头
l         去离子水
l         坐标纸(log/log)
l         用于稀释标准品的试管
l         洗涤瓶


 

试剂准备
1.       洗涤缓冲液制备:先将洗涤浓缩液平衡至室温,充分混匀,然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀,即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内,并于2周内使用
2.       标记抗体的制备:用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍,即得。
例:如果只测一条板,8孔,则需要标记抗体800ul(30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液,混匀,使用时每孔加100ul)
此步骤在实验前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内,保存在4℃
3.       标准品的制备:吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内,充分混匀,得到2000pg/ml的人VEGF标准品
4.       标准品的稀释:准备8个试管用于标准品的稀释,每管加入230ul的EIA缓冲液
每管的浓度如下
1号管                 1000pg/ml
2号管                 500pg/ml
3号管                 250pg/ml
4号管                 125pg/ml
5号管                62.5pg/ml
6号管                 31.25pg/ml
7号管                15.63pg/ml
8号管                 0pg/ml(试验样品空白)
吸取230ul的标准品于1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管,依次连续稀释,标准品范围为1000~15.63pg/ml
 
5.       样品稀释:样品用EIA缓冲液稀释。如果样品浓度事先没有估计,我们建议,先用几个不同稀释比例的样品进行检测,来确定样品的zui佳稀释比例
实验步骤
使用前,所有样品应平衡至室温,大约30min,然后充分混匀,确保试剂质量无变化,标准曲线和样品检测同时进行

试剂
检测样品
标准品
检测样品对照孔
试剂对照孔
检测样品100ul
稀释标准品(1-7管)100ul
EIA缓冲液(第8管) 100ul
EIA缓冲液100ul
盖板,37℃下温育60min或4℃下温育一夜
洗板7次
酶标抗体
100ul
100ul
100ul
-
盖板,4℃下温育30min
洗板9次
显色剂
100ul
100ul
100ul
100ul
室温避光温育30min
终止液
100ul
100ul
100ul
100ul
加终止液后30min内450nm处读取OD值

1)  确定好空白对照孔,并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。
2)  确定好样品对照孔,检测样品孔和标准品孔,然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。
3)  盖板,37℃下温育60min或4℃下温育一夜
4)  用洗涤瓶洗板,在微孔中加入洗涤液浸泡15-30秒,弃取洗涤液。重复7次,zui后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时,用洗板机洗四次后,在用洗涤瓶洗3次。
5)  每孔加100ul酶标抗体,除试剂空白对照孔外
6)  盖板,4℃下温育30min
7)  按照步骤4)洗板9次
8)  将所需量的显色剂加入到试管中,然后在每一微孔中加入100ul显色剂。为了避免污染,请勿将剩余试剂在倒入原装试剂瓶中。
9)  室温避光温育30min,加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
10)在每孔加100ul终止液,此时溶液颜色会变成黄色。
11)              擦去微孔板底部的污点或水滴,终止液加入后30min内,在酶标仪450nm处读数
特别注意
1.       试验样品采集后应立即检测,冻存的样品避免反复冻融,检测前应先将其完全溶解混匀
2.       试验样品用EIA缓冲液稀释
3.       试验样品和标准品应做双份检测
4.       试验样品应在中性PH范围,有机溶剂的污染可能会影响检测
5.       只能用试剂盒提供的洗涤液洗板,否则会导致试验失败
6.       吸水纸上拍干微孔板,不能擦拭
7.       TMB底物液应贮存于黑暗处,因其对光敏感,且避免接触金属
8.       加入终止液后30min内必须酶标仪读数
9.       肝素血浆样品的检测值低于EDTA血浆样品
结果计算
   绘制曲线前,所有的数据都应减去试验样品空白值,包括标准品和未知的样品。以标准品的OD值和浓度在对数-对数坐标纸上绘制标准曲线,从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度
 
附:采用全自动酶标仪检测,只需检测前设置好酶标仪的相关参数,如坐标参数(线性,半对数)和计算方式参数(三次回归、四参数或双对数曲线方程),即可直接得到结果
 
 
本译文仅供参考,详情请以原文为准。
 
 
 
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