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环氧合酶-2 (COX-2) ELISA说明书
环氧合酶-2 (COX-2) ELISA说明书
日本IBL原装进口,货号:27186
日本IBL中国*代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务
 
日本IBL中国*代理商,环氧合酶-2 (COX-2)简介
COX是一种膜结合酶,负责花生烯酸氧化生成前列腺素G2(PGG2)以及随后PGG2转变为PHG2。这是各种前列腺素生成的*步。COX至少有两种不同的亚型,组成表达型COX-1,和诱导型COX-2。COX-1行使着看家功能,如血管止血,肾流血量,肾小球功能维护。COX-2存在于部分细胞内,发出炎症信号,如生长因子,细胞因子和内毒素。
日本IBL中国*代理商,环氧合酶-2 (COX-2)实验原理
试剂盒采用夹心酶免法,采用了两种高特异性抗体,TMB作为着色剂,zui终溶液所显示的颜色强度与样品中COX-2的量成正比
检测范围
1.09~70ng/mL
日本IBL中国*代理商,环氧合酶-2 (COX-2)预期用途
1.       试剂盒可用于细胞上清裂解液中人COX-2的检测
细胞培养液
1)    将细胞培养液(1x105~1x107个细胞)加入至0.5ml的IBL裂解液中(货号为#19022)
2)    在振荡器上混匀或用移液枪吹打混匀
3)    2-8℃下旋转30min使其溶解
4)    2-8℃,10000rpm下离心10min
5)    有必要的话用EIA缓冲液稀释上清液
2.       细胞裂解液试验中,建议所用细胞数应一致
3.       建议总蛋白浓度也同时检测,可检测到人COX-2与总蛋白的关系
日本IBL中国*代理商,环氧合酶-2 (COX-2)试剂盒组成
1.       微孔板,96孔,包被有抗人COX-2鼠IgG单抗
2.       酶标抗体浓缩液,30X,HRP标记的抗COX-2兔IgG Fab片段,0.4ml
3.       标准品,重组人COX-2,0.5mlx2
4.       EIA缓冲液,30ml
5.       酶标抗体稀释液,内含的1%BSA、0.05%的吐温20的PBS缓冲液,12ml
6.       显色剂,TMB,15ml
7.       终止液,1N硫酸,12ml
8.       洗涤缓冲浓缩液,50ml,40X,0.05%吐温20的磷酸缓冲液
日本IBL中国*代理商,环氧合酶-2 (COX-2)操作指南
实验所需器材但试剂盒不提供
1.     酶标仪(450nm)
2.     微量移液器和取样吸头
3.     带刻度的量筒与烧杯
4.     蒸馏水
5.     温育器(37℃±1℃)
6.     冷床箱(4℃)
7.     坐标纸(log/log)
8.     吸水纸
9.     用于稀释标准品的试管
10.  洗涤瓶
11.  酶标抗体稀释的一次性试管
准备
1.       洗涤缓冲液制备:先将洗涤浓缩液平衡至室温,充分混匀,然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀,即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内,并于2周内用完
2.       标记抗体的制备:用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍,即得。
例:如果只测一条板,8孔,则需要标记抗体800ul(30ul的标记抗体浓缩+870ul的标记抗体稀释液,混匀,使用时每孔加100ul)
此步骤在实验前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内,保存在4℃
3.       标准品的制备:吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内,充分混匀,得到140ng/ml的人COX-2标准品
4.       标准品的稀释:准备8个试管用于标准品的稀释,每管加入230ul的EIA缓冲液
每管的浓度如下
1号管                 70 ng/ml
2号管                 35ng/ml
3号管                 17.5ng/ml
4号管                 8.75ng/ml
5号管                 4.38ng/ml
6号管                 2.19ng/ml
7号管                 1.09ng/ml
8号管                 0pg/ml(试验样品空白)
吸取230ul的标准品于1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管,依次连续稀释,标准品范围为70~1.09ng/ml
 
5.       样品稀释:样品用EIA缓冲液稀释
实验步骤
使用前,所有样品应平衡至室温,大约30min,然后充分混匀,确保试剂质量无变化,标准曲线和样品检测同时进行

试剂
检测样品
标准品
检测样品对照孔
试剂对照孔
检测样品100ul
稀释标准品(1-7管)100ul
EIA缓冲液(第8管) 100ul
EIA缓冲液100ul
盖板,37℃下孵育60min
洗板7次
酶标抗体
100ul
100ul
100ul
-
盖板,4℃下孵育30min
洗板9次
显色剂
100ul
100ul
100ul
100ul
室温避光温育30min
终止液
100ul
100ul
100ul
100ul
加终止液后30min内450nm处读取OD值

1.     确定好空白孔,并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。
2.     确定好样品对照孔,检测样品孔和标准品孔,然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。
3.     盖板,37℃孵育60min
4.     用洗瓶洗板,在微孔中加入洗涤液再浸泡15-30秒,弃取洗涤液。重复7次,zui后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时,用洗板机洗四次后,再用洗瓶洗3次。
5.     每孔加入100ul酶标抗体。
6.     盖板,4℃下温育30min
7.     按照步骤4)洗板9次
8.     将所需量的显色剂加入到试管中,然后每孔内加入100ul显色剂。为了避免污染,请勿将剩余试剂倒入显色剂原装瓶中。
9.     室温避光温育30min,加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
10.  每孔中加入100ul终止液,此时溶液颜色会变成黄色。
11.  除去包被板孔底的杂质或水滴,同时确保液体表面无泡沫, 30min内在450处读取OD值。
特别注意
1.     样品采集后应立即检测,如需贮存的,则应放置在冰冻条件下,避免反复冻融,检测前应在低温下将其溶解并完全混合
2.     如有需要,样品可用EIA缓冲液稀释
3.     建议试验样品和标准品做双份检测
4.     试验样品应在中性PH范围内,有机溶剂的污染会影响试验
5.     只能使用试剂盒内提供的洗涤液洗板,洗板不充足可能会导致试验失败
6.     彻底倒去洗涤液,吸水纸上拍干,不能用吸水纸擦拭微孔
7.     底物液应避光保存,因其对光敏感,且要避免接触金属
8.     加入终止液后30min内读数
结果计算
绘制标准曲线前,将所有的检测孔(包括标准品和未知样品)的OD值都减去检测样品空白孔的OD值。在对数坐标纸上,以标准品的OD值(减去空白后的值)对其相应的浓度,通过这些点作一条平滑的标准曲线。我们可以从标准曲线上读取未知样品的浓度值。
典型标准曲线
 
附:采用全自动酶标仪检测,只需检测前设置好酶标仪的相关参数,如坐标参数(线性,半对数)和计算方式参数(三次回归、四参数或双对数曲线方程),即可直接得到结
 
 
本译文仅供参考,详情请以原文为准。
 
 
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