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去甲变肾上腺素ELISA Kit使用说明书

点击次数:1391 发布时间:2011/8/31
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去甲变肾上腺素ELISA Kit使用说明书

德国IBLRE59171)

前言说明

儿茶酚胺类肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺都是在肾上腺髓质、交感神经系统和脑中合成的。它们几乎影响所有的组织,并与其它激素和神经系统一起参与各种生理过程的调节。因为儿茶酚胺类物质以及它们的代谢产物变肾上腺素和去甲变肾上腺素在许多疾病中的分泌都会增加,因此对它们进行检测可用于这些疾病的诊断。在这一实验中,诊断和神经系统的续发性肿瘤都具有特殊的重要性。这一技术主要用于嗜铬细胞瘤、神经细胞瘤和神经节细胞瘤的诊断检测。10%的嗜铬细胞瘤表现为恶性增长。而在良性肿瘤中可发现儿茶酚胺类物质及它们的代谢产物变肾上腺素和去甲变肾上腺素都会增加。

1、应用范围

此酶免试剂盒可用于人体尿液中去甲变肾上腺素的体外定量检测,可手动操作也可自动操作.

2、实验原理

ELISA试剂盒利用的是竞争法原理,生物素标记抗原和未用生物素标记抗原竞争结合一定量的抗体结合位点。结合到抗体上生物素标记抗原的量与样品中被分析物的浓度成反比。反应系统达到平衡后,未结合的生物素标记的抗原用洗涤液洗去。以抗生物素碱性磷酸酶作为标记物,以PNPP(对硝基苯酚磷酸盐作为底物液来检测结合到抗体上的生物素抗原的量。将未知物的酶反应活性和已知标准品的反应曲线相比较,可以得到未知物的量。

3、 意事项和预防措施

1)      此试剂盒仅用于体外诊断和专业人士使用。

2)      在检测开始之前,仔细和完整的阅读说明书,使用试剂盒提供的包装插件的有效版本, 确保所有的程序都清楚。寻求更多信息(比如:临床背景,检测操作,自动化操作说明,可选择的软件,文献等等),请查看IBL公司主页。

3)      如果试剂盒有破坏的请与IBL公司或是提交你的申请,但自您拿到试剂盒后zui迟不超过一个星期。检测时请不要使用已被损害的试剂,以确保自身安全。

4)      按照批号和有效期,不混合使用不同批号的试剂,也不要使用过期的试剂。

5)      遵守好的实验准则和安全指南。穿实验服,带橡皮手套,有必要时请戴护目镜。

6)      此试剂盒中含有会伤害眼睛和皮肤的有害试剂。请阅读材料来源和标签获取详细信息。产品的材料安全数据单能够从IBL公司主页上下载,也可直接咨询IBL公司获取。

7)      根据国家生物有害物质及安全条例,所有化学药品和准备或使用过的试剂都应当做有害物质进行处理。

8)      不要接触终止液,以免造成皮肤损伤或着烧。

4、 存与稳定性

试剂盒和运输环境和储存环境温度为2-8,避免热源或太阳直射。样品的储存与稳定性及试剂的准备将在相关章节中阐述。开封的试剂盒在有效期内稳定,前提是要将试剂盒用袋子密封并储存于2-8的环境下。

5、 样品的采集与贮存

注意

人体内的儿茶酚氨和间甲肾上腺素的释放会受到一些食品和药物的影响。因此在样品采集前72小时内病人应禁止服用下列食物和药品:维生素B,咖啡,香蕉,α甲基多巴,MAOCOMT抑制剂,还有降血压类药物。

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。将病人24h内的所有尿液都收集到,并混合于含10-15ml 6NHCl防腐剂的试剂瓶中。

贮存

-20

避免热源或太阳直射,避免反复冻融,冷冻状态下运输样品。

稳定性

6个月

6、 试剂盒成分

注意

试剂盒有足够做96份单孔检测或48份双孔检测或间甲肾上腺素和去甲变肾上腺素共同检测时所需的试剂成分

 

数量

标记

成分

1×50mL

ASSAYBUF CONC

检测缓冲液,10倍浓缩,内含磷酸缓冲液,BSA(牛血清白蛋白),1%NaN3

1×2.25mL

ACYLREAG

酰化试剂,即用,内含二甲基甲酰胺

1×10mL

INDICATIORBUF

指示剂缓冲液,紫色,即用,内含Tris缓冲液和苯酚红(pH小于7.5时颜色会发生变化)。

2×50×

HYDRTUB

水解试管,可处理的聚苯乙烯试管

1×20mL

HCl

HCl,即用,内含0.1M HCl

1×12×8

MTP

包被板,可拆分,包被有抗兔IgG(羊,多克隆)

1×7×0.35mL

CAL A-G

标准品,A-G含去甲变肾上腺素和0.1MHCl

0; 77; 192; 480; 1200; 3000; 7500μmol/L

0; 0.42; 1.05; 2.63; 6.56; 16.4; 41.0μmol/L

1×2×0.5mL

CONTROL 1+2

质控1+2,即用,浓度及允许范围请见标签

3×

BIOTIN LYO

去甲变肾上腺素生物素冻干品,内含去变甲状腺生物素,  Tris缓冲液,<0.1%NaN3(可再生

1×7m L

ANTISERUM

去甲变肾上腺素抗血清,内含含抗血清),磷酸缓冲液,0.1%NaN3

1×250μl

ENZCONJ CONC

酶联物(100×,含抗生物素抗体,并联结到碱性磷酸酶上,Tris缓冲液,0.01%NaN3

9×

PNPP SUBS

PNPP底物片,含PNPP

1×27mL

PNPP BUF

PNPP底物缓冲液,含二乙醇胺、水和0.05%NaN3

1×15mL

PNPP STOP

PNPP终止液,即用,内含1MNaOH0.25MEDTA

1×50mL

WASHBUF CONC

洗涤液(10×,含Tris缓冲液,HCL,吐温,0.2%NaN3

3×

FOIL

粘性金属板

7、实验所需器材(但试剂盒不提供)

1)      移液器,体积:10;50;100;1000ul

2)      玻璃试管(12×75mm

3)      振荡器(200-900rpm

4)      旋涡混合器

5)      水浴箱,90

6)      带试剂储器的8孔移液器

7)      洗涤瓶,自动或半自动包被板洗涤系统。

8)      可在405nm处读数的酶标仪(参考波长:600-650nm

9)      双蒸水或去离子水

10)  吸水纸,取样吸头和计时器

8、注意事项

1)      样品的不合理处理及实验操作的任何改动都将影响实验结果。取样体积、温育时间、欲处理步骤都必须严格按说明进行。只能使用标准移液器和标准设备。

2)      一旦实验开始,所有的步骤都必须完整的进行下去,切勿中断。确保所有试剂、材料和设备都已准备好。把所有试剂和样品都平衡至18-25,在使用前,轻轻摇动液体试剂和样品,试剂混合过程时要避免产生气泡。

3)      请勿接触试剂、移液器、微孔/试管。加试剂和样本时,请使用新的吸头,以避免交叉污染。不用的试剂应用盖子盖好,以免重复使用。

4)      我们建议对样品进行双份检测,以便能纠正潜在的滴定错误

5)      用定标仪对反应板进行校准。

6)      温育时间会影响实验结果。微孔加样的顺序和时间都必须一致。建议使用8孔移液器加样。

7)      包被板的清洗很重要,清洗不合理将会导致错误的实验结果。建议使用多孔移液器或自动包被板清洗系统进行清洗。温育期间避免微孔干燥,清洗和吸液时不要碰到包被板微孔。清洗时,确保所有的微孔都充满蒸馏水,并且无残留物。

8)      湿度会对包被孔产生影响,所以包被板未平衡到室温时不要打开包装。不使用的微孔应立即装入含干燥剂的包装袋中。

9、实验前的准备说明

手动或自动操作参考说明

注意

这种96人份的试剂盒可分成3份独立进行,以下体积为4条(32人份)一次检测所需体积。如果想把标准品从7份减到6份,可以把标准品G弃取。而允许范围相应的减少到3000μg/l

如果检测是用了很多板条,则体积应相应改变。

9.1冻干成分或浓缩成分的准备

特别注意

如果你使用甲状腺ELISA试剂盒来同时检测间甲肾上腺素和去甲变肾上腺素,请勿混合间甲肾上腺素和去甲变肾上腺素酶联物。

稀释/溶解

成分

 

稀释

比例

备注

贮存

稳定性

15mL

检测用缓冲液

150mL

双蒸水

1:10

 

2-8°C

2

15mL

洗涤液

150mL

双蒸水

1:10

 

2-8°C

4

1

去甲变肾上腺素生物素

2mL

稀释的检测缓冲液

 

临时配制,仅使用一次,静置5min,混合时避免气泡.

-20°C

2个月

60μl

酶联物

6mL

稀释的检测缓冲液

1:101

临时配制,仅使用一次

18-25°C

5小时

3

PNPP底物片

8mL

PNPP底物缓冲液

 

临时配制,仅使用一次

18-25°C

5小时

9.2总去甲变肾上腺素检测用的尿液样品、标准品和质控品的水解(在水解试管中)

注意

水解这一步骤在总去甲变肾上腺素和总间甲肾上腺素的检测中是必备的。而在游离去甲变肾上腺素和变肾上腺素的检测中则无须水解。样品被怀疑高于zui高标准的样品必须在水解步骤前用0.1M HCL进行稀释。

9.2.1水解试管中样品的准备

1)      将标准品、质控品和尿液样品各10μL加入到相应的水解试管中

2)      在每一试管中加入40μL0.1MHCl

3)      盖好试管,90°C下水解1h(用温度计测温度)。之后平衡至室温,旋涡混合。

4)      在每一试管中加入100μL指示剂缓冲液,旋涡混合。

5)      在每一试管中加入20μL的酰化作用试剂,加入指示剂后立即震荡,确保加入的酰化试剂和试管内物质完全混合。

6)      盖好试管,室温下温育15min

7)      在每一试管中加入1mL稀释的检测缓冲液。

10、实验步骤

手动和自动操作

1)      将酰化标准品、酰化质控品和酰化病人样品分别50μL加入到相应的微孔中。

2)      在每一微孔中加入50μL去甲变肾上腺素生物素。

3)      在每一微孔中加入50μL去甲变肾上腺素抗血清。

4)      盖板,小心振荡包被板。振荡器(500rpm)上室温温育1h500rpm

5)      移去粘性金属板。弃取孔内反应液,每孔用250μL洗涤液洗板6次(洗板机洗),(人工清洗则洗3次即可,吸水纸上拍干。

6)      在每一微孔中加入150μL临时配制的酶联物。

7)      盖上一新的粘性金属板。振荡器(500rpm)上室温(18-25)温育30min

8)      移去粘性金属板。弃取孔内反应液,每孔用250μL洗涤液洗板6次(洗板机洗),(人工清洗则洗3次即可,吸水纸上拍干。

9)      如果有条件的话,使用8孔微量移液器加底物液和终止液时。确保底物液和终止液都是相同的时间间隔加入。使用自动置换型移液器并避免气泡产生。

10)  在每一微孔中加入100μL临时配制的PNPP底物液。

11)  振荡器(500rpm)上室温(18-25)温育20min

12)  在每一微孔中加入100μL PNPP终止液以终止底物反应,轻轻振板以混合溶液。

13)  加入终止液后60min之内在405nm处测OD值(参考波长:60 0-650nm

11、结果计算

在半对数坐标纸上或用自动的方法,以标准品的OD值为Y轴,浓度为X轴,绘制一条标准曲线。用立体图、4参数对数图或对数-对数图都可获得良好的实验结果。对于标准曲线图,用标准品的每一单值进行计算(样品结果明显异常的值必须删除掉,应使用更加合理的单值)。样品的浓度可直接从标准曲线上获得。一旦样品稀释了,就应当乘以相应的稀释因子。如果样品所测得的浓度高于zui高标准,则应根据实验前准备说明所述对样品进行稀释,并重新检测。

计算每一尿液样品的24小时的排泄量:μg/24h=μg/L×L/24h

转换:1ng/mL=1μmol/L

去甲变肾上腺素(μg/L)×5.46×10-3=μmol/L

12、期望值

实验结果不能当作判断任何治疗结果的*因素,疾病的判断还应当与其它临床观察和诊断检测相结合。以下结果为正常人群的正常值(5%-95%):

平均值:230ug/d    范围:35-445ug/d95%

建议每个实验室都确定自己实验室的正常值范围。

 

 

 

 

本译文仅供参考,详情请以原文为准。

 

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