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激素六项之黄体生成素(LH)

黄体生成素(LHELISA试剂盒

 德国DRGEIA-1289)

1、 应用范围

DRG公司的LH酶联免疫吸附试剂盒可用于血清中黄体生成素(LH)的定量检测。此检测试剂盒仅供体外诊断用。

2、前言说明

在受到下丘脑释放的黄体生成素释放激素(LH-RH或者Gn-RH)的影响下,男性和女性的垂体前叶都可以产生LH(黄体生成素)。在男性中,LH也叫做促间质细胞激素(ICSH),它是一种分子量大约为30000道尔顿的糖蛋白。它是由两条不同的氨基酸链通过非共价键结合形成的复合物,一条α链,一条β链。α链与在人促甲状腺激素(TSH)、卵泡刺激素(FSH)和人绒毛膜促性腺激素中找到的α链糖蛋白类似。这些激素的不同主要是由于他们β链的氨基酸组成不同所造成的,这也使它们产生了不同的免疫学功能。男性中LH的分泌是间歇性的,它的基本功能是刺激间质细胞(莱迪希细胞)分泌睾酮。妇女体内LH浓度的变化会受到正常月经复杂排卵循环的影响,这也依赖于沿性腺-下丘脑-垂体轴的一系列激素活动。排卵前孕酮和雌二醇水平的降低启动了每一个月经周期。随着激素水平的降低,下丘脑就增加促性腺激素释放激素(GnRF)的分泌,它可依次刺激垂体增加FSH的生产和分泌。增加的FSH水平在卵泡阶段可刺激一些卵泡的成熟,其中的一个卵泡就会成熟为含卵子的卵泡。随着卵泡的发育,雌二醇就开始分泌,刚开始时很慢,但经过1213天的正常循环后它就开始迅速增加。因为垂体的直接刺激和增加的GnRFFSH水平,雌二醇的就开始迅速增加,随之LH就开始释放了。而这些事件正好组成了排卵前期。在LH达到zui高水平后,排卵作用大约会持续1218个小时。排卵后就会形成可分泌孕酮和雌激素(这两种激素是LH的两个反馈调节物)的黄体。黄体期迅速的紧随排卵期而来,黄体期明显表现为高孕酮水平,雌二醇第二增加,低LHFSH水平。低LHFSH水平是沿下丘脑-垂体轴雌二醇和孕酮负反馈反应的结果。受孕后,胚胎的发育可产生hCGhCG使得黄体继续产生孕酮和雌二醇。如果没有受孕,黄体就会退化,相应的孕酮和雌二醇水平就会降低,从而导致了月经的形成。随着这些激素低激素水平的形成,下丘脑就又再次开始一月经周期患性腺机能退减的病人,其血清LH的浓度会增加。由于卵巢的发育不成熟、原发性的卵巢功能衰竭、多囊卵巢疾病或绝经等原因,女性体内类固醇激素的分泌会减少,而且在这些情况下,LH的分泌没有受到调节。在男性中,但睾丸发育不正常或存在无睾畸形时,也同样会失去调节激素。在原发性睾丸衰竭和克氏综合征患者中,尽管在雄性激素持续分泌的情况下LH浓度没有必要提高,但我们也可发现其体内存在着高浓度的LH。在肾衰竭、肝硬化、甲状腺功能亢进和严重饥饿的情况下,LH的浓度也可出现提高。垂体前叶激素的分泌不足也可能导致低LH水平。正如人们所预测的,低LH水平可能导致男性和女性不育。虽然LH的低水平在垂体前叶对GnTH刺激反应失效的情况下也会出现,但由于下丘脑GnRH分泌的降低,LH的水平就有可能降低。因此低LH水平可表明垂体或下丘脑存在功能障碍,但具体的问题根源必须通过其它实验确定。在下丘脑、垂体或性腺功能障碍的鉴别诊断中,LH浓度的检测常与FSH一起进行检测(以为两者的功能紧密相连)。此外,激素的水平也可用来确定是否绝经、计算排卵时间和监测内分泌治疗效果。

3、实验原理

   DRG公司的LH酶免实验是一种基于夹心法原理的固相酶免吸附实验(ELISA)。反应板上的微检测孔包被有能结合LH分子上独特抗原位点的单克隆抗体。一份含有内源性LH的病人样本在包被孔中与酶联物进行孵育,该酶联物是一种联结有辣根过氧化物酶的抗LH抗血清。孵育后,用洗涤液洗去未结合的酶联物。辣根过氧化物酶符合物的总量与样本中LH的浓度成正相关。加入底物溶液后,显出的颜色强度与病人样品中LH的浓度成正比。

4、试剂盒组成:

1)      微量反应板,1 ( 96,包被了抗LH的单克隆抗体。

2)      标准系列:6支,冻干,1ml,浓度: 0,10,20,40,100,200mIU/ml

3)      酶联物,1支,11ml,辣根过氧酶标记的抗LH抗血清,0.3%Proclin作为防腐剂。 

4)      底物液,14ml (TMB)

5)      终止液:1支,0.5M H2SO4, 14ml,避免接触终止液,以免刺激或着烧皮肤。

用于样品稀释的零标准品应视需要而定。

5、实验所需器材(但试剂盒不提供)

1)酶标仪

2)移液器,2550100μl.

3)蒸馏水

4)吸水纸

5)计时器

6)半对数纸

6、储存条件

   未开启的试剂在28℃下贮存,在有效期内可以保持活性。不要使用过期试剂,酶联物、底物溶液、标准品和零标准品必须在28℃下贮存。

   微孔反应板必须在28℃下贮存。一旦包装袋被打开,必须将它小心地严封起来。如果包被板的包装被打开,其免疫活性在6周内稳定,但前提是必须将它密封在装有干燥剂的袋子里。

7、试剂准备

实验开始前,将所有试剂和所需数目的板条都平衡至室温。

标准品:在每支冻干粉的标准品中加入1.0ml蒸馏水重新配置标准品。注意:配制好的标准品在2-8℃的环境下可稳定存放2个月,要想存放更长的时间则应冻存于-20℃的环境下。

8、样品

此实验将用到血清,请不要使用易溶血、黄疸血和脂血样品,注意:含叠氮钠的样品不可用于此实验。

8.1样品的采集

血清:静脉穿刺采集全血,待其凝固,室温离心分离血清。未完全凝血前请勿离心,接受了抗凝剂治疗的病人可能需要更长的凝血时间。

8.2样品储存

实验开始前应用盖子将样品密封好,2-8℃下可存放48小时。如果将样品冻存于-20℃的环境下则可将其存放更长时间(只可冻融1次)。解冻的样本在实验之前必须要上下倒置几次。

8.3样品的稀释:

在*次实验中,样本浓度高于zui高标准品的样品应当在实验前用零缓冲液进行稀释。在计算浓度时,应当把此稀释因子考虑进去。例子:

a)110稀释: 10μL的血清+90μL的零缓冲液(充分混合)。

b)1100稀释:10ul稀释好的a+90μL的零缓冲液(充分混合)。

9、实验步骤

所有的标准品、样品和质控品都必须做双份检测以保证它们的检测条件都一样。每次检测都必须有一条标准曲线。

1)      将所需数目的板条置于板架上。

2)      将标准品、质控和血清样本分别25μl加入到相应的微孔中,每次都得使用新的取样吸头。

3)      100μl的抗LH酶联物于各孔中。

4)      混匀10,此步骤中完全混匀很重要。

5)      室温温育(22)30分钟。

6)      弃去孔内的反应液。用蒸馏水洗板5次(每孔400ul),在吸水纸上把板拍干以除去残余液体。注意:洗板步骤是否正确会明显影响实验的灵敏度和精密度。

7)      依原先加样顺序,每孔加100μl底物液。

8)      室温(22温育10分钟。

9)      按加底物液顺序,每孔加50μl终止液于各孔中。

10)  加终止液后10分钟内在450nm波长读吸光度。

10、结果计算

1)      计算每个标准品、质控品和病人样本的平均吸光度值。

2)      用吸光度值作为纵坐标(y),浓度值作为横坐标(x),以每个标准品的吸光度值对其相应的浓度值(mIU/ml)进行标绘,作一条标准曲线。

3)      用每一样品的平均吸光度值在标准曲线上确定其相应的浓度。

4)      自动计算方法:说明书上的结果是用四参数计算得到的,其它的归纳方法可能会给出稍微不同的结果。

5)      样品的浓度可直接从标准曲线上读取。样品中LH浓度高于zui高标准品的必须进行进一步的稀释,任何稀释了的样品在计算时都必须将相应的稀释因子考虑进去。

11、正常值

强烈建议每个实验室都确定自己的正常值范围和不正常值范围。

DRG公司的LH ELISA试剂盒对明显健康人群进行一研究,得到如下结果:

人群

LHmIU/ml

成年女性

卵泡和黄体期

20

黄体生成素峰

20-200

女性绝经后

20-100

 

男性

3-12

 

 

 

本译文仅供参考,详情请以原文为准。

 

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