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抑制素B(INH—B)ELISA Kit酶免试验说明书

抑制素B(INH—B)ELISA Kit酶免试验说明书

美国进口原装RayBiotechCat:EIA-INB-1

简介

    抑制素B属于TGF-β超家族,家族成员包括抑制素ATGF-B,活化素,骨成型蛋白,其中抑制素与活化素相关性zui为密切。

    活化素和抑制素都是二聚体蛋白复合结构,每个复合物都是由两个单元结构经二硫键连接组成的。此外,两个复合物都来自同一家族的相关基因和蛋白质,但不同在他们的亚基组成,抑制素是由两个不同的亚单位(a单元与b单元)经二硫键连接形成

抑制素B是由一个alpha单元和一个betaB单元组成

抑制素A是由一个alpha单元和一个betaA单元组成

活化素有同构二聚体和异构二聚体,活化素A2betaA单元),活化素B2betaB单元),或者是活化素AB1betaA和一个betaB单元)

抑制素在生殖调节方面有着重要的作用。抑制素和活化素在作为生殖轴的调节器时通常发挥相反的作用,而在生殖生理学调节方面可发挥多种作用。zui近报道称抑制素在肿瘤方面已有新发现。抑制素在多个细胞组织内被报道为潜在的肿瘤基因,包括前列腺,卵巢,子宫内膜和乳房,抑制素的低表达或低灵敏度都与肿瘤的起始和恶化相关联

 

实验原理

抑制素B酶免试剂盒用于抑制素B肽的定量检测,依据的是竞争酶免法

包被板内预包被了抗兔二抗, 抗抑制素B抗体经封闭、孵育后,生物素标记的抑制素B肽和标准品或样品中的目的肽会竞争结合抑制素B抗体,结合的生物素B肽与辣根过氧化物酶连接,会发生颜色改变。颜色强度与复合物的量成正比,而与标准品或样品中的抑制素B的量成反比。这是由于生物素标记的抑制素B肽和标准品或样品竞争结合抑制素B抗体。样品浓度可从标准曲线上读取

 

试剂盒组成

1.       包被板 96T,包被有二抗

2.       洗涤缓冲浓缩液(20X 25mL

3.       标准品 2支,10µl/

4.       抗抑制素B单抗 2支,5µl/

5.       试验稀释液A  30mL,含0.09%的叠氮化物作为防腐剂,用于标准品和血清或血浆样品的稀释

6.       试验稀释液B  15mL5X的浓缩缓冲液,用于稀释标准品和上清液或其他样品

7.       生物素标记物  2支,20µl/

8.       辣根过氧化物酶浓缩液  8µl20000X酶连液

9.       阳性质控 1支,100µl

10.   TMB显色液  12mL

11.   终止液  8mL2M的硫酸

12.   坐标纸

13.   说明书

 

储存条件

标准品,生物素标记物和阳性质控应保存在-20℃或者-80(建议-80℃),避免反复冻融

其他试剂保存在-20

开封的包被板和抗体在2-8℃下可保存1个月以上,不用的包被板应重新装入干燥的密封袋内

 

实验所需材料(但试剂盒未提供的)

所需材料省略!

 

试剂准备

如果检测的是血清或血浆,则用试验稀释液A稀释生物素标记物和标准品,如果检测的是上清或其他样品,则用试验稀释液B稀释。

1.       试剂准备阶段都要在冰浴上进行,打开密封袋之前包被板要平衡至室温

2.       试验稀释液B需用去离子水稀释5

3.       抗抑制素B抗体使用前应离心,然后加入50µl 1X的试验稀释液B,移液枪吹打混匀,得到抗体浓缩液。

4.       抗体浓缩液再用1X的试验稀释液B稀释100倍,这就是抗抑制素B抗体工作液。

5.       生物素标记物使用前离心,然后吸取5µl5mL的试验稀释液混合,zui终得到100pg/ml的生物素标记物

6.       标准品的准备:一次标记6个试管,浓度依次为10000pg/ml1000pg/ml100pg/ml10pg/ml1pg/ml0pg/ml。除了10000pg/ml的试管外,其余每管加入450µl生物素标记物。确保所有标准品中生物素标记物的浓度是100 pg/ml很重要。

抑制素B先离心,然后吸取8µl抑制素B792µl100pg/ml生物素标记物混合,这就得到了抑制素Bstock溶液,混匀,作为1号标准品,标记10000pg/ml,接下来可按如下图进行稀释


 

7.       生物素标记物进行10倍稀释,2µl的生物素标记物和18µl的试验稀释液混合。

8.       阳性质控:离心,在阳性质控管内加101µl的试验稀释液B,然后再加入4µl 10倍稀释了的生物素标记物,这就是2倍稀释的阳性质控。

9.       如果洗涤浓缩液含有可见沉淀物,将其平衡至室温,摇晃直至溶解。20mL的洗涤浓缩液用蒸馏水稀释至400mL 1X的洗涤缓冲液

10.   样品:血清血浆样品用试验稀释液A和生物素标记物稀释,而上清液和其他样品则用1X的试验稀释液B和生物素标记物稀释。确保样品中生物素标记物的zui终浓度为100 pg/ml很重要

11.   过氧化物酶使用前应进行离心,用1X的试验稀释液B进行20000倍的稀释

 

实验步骤

1.       试剂准备阶段应在冰浴上进行,所有标准品和样品都应做一平行样

2.       每孔内加入100µl抗抑制素B抗体,室温下振荡孵育1.5小时,也可在4℃下孵育过夜

3.       弃去液体,用1X的洗涤缓冲液(200-300µl)洗涤4次,吸水纸上拍干

4.       标准品,阳性质控和样品各100µl加入相应的孔内,盖板,室温下振荡孵育2.5小时,或是4℃过夜

5.       弃去液体,洗板4

6.       每孔加入100µl的过氧化物酶溶液,室温下孵育45min,孵育时间要把握好

7.       弃去液体,洗板4

8.       每孔加入100µlTMB底物液,暗处室温下振荡孵育30min

9.       每孔加入50µl的终止液,立即用酶标仪读数

 

结果计算

计算各标准品,质控品和样品的OD均值,减去空白组OD值。以标准品浓度为X轴,吸光率为Y轴,坐标纸上画标准曲线。

吸收率=B-OD空白/B0-OD空白

B=样品和标准品的OD

B0=零标准品的OD

 

本译文仅供参考,详情请以原文为准。

 

 

 

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