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人环磷酸鸟苷(ELISA)酶联免疫试验说明书
人环磷酸鸟苷酶联免疫试验
(德国IBL CM581021)
预期用途
此酶免试剂盒用于细胞裂解液,组织,血浆和尿液中cGMP的定量检测
 
实验原理
此试剂盒采用的竞争酶免法,游离的cGMP和乙酰胆碱酯酶标记的cGMP共同竞争结合位点上一定量的cGMP特异性兔抗。由于标记的cGMP量不变,随着游离的cGMP的不同,标记cGMP与兔抗结合,结合的量与孔内游离的cGMP浓度成反比。兔抗-cGMP复合物再与预先包被在微孔板内的鼠单抗抗兔IgG结合,洗板洗去未结合的复合物,然后加入底物显色液,反应液有明显的黄色并在412nm处有强吸光度值,显色强度与结合的标记cGMP浓度成正比,而与游离的cGMP成反比。
 
试剂盒组成

编号
成分
96孔
480孔
481022
抗血清
1支
1支
481020
乙酰胆碱酯酶
1支
1支
481024
标准品
1支
1支
400060
缓冲浓缩液(10X)
2支/10ml
4支/10ml
400062
洗涤缓冲浓缩液(400X)
1支/5ml
1支/12.5ml
400035
吐温20
1支/3ml
1支/3ml
400004
鼠抗兔IgG包被板
1块
5块
400012
盖板
1块
5块
400050
Ellman’s试剂
3支/100dtn
6支/250dtn
400031
无水醋酸
1支/2.5ml
1支/12.5ml
400029
KOH
1支
1支
400040
示踪染料
1支
1支
400042
抗血清染料
1支
1支

 
实验所需材料但试剂盒未提供
1.      酶标仪 405-420nm
2.      可调节的移液管和可重复使用的吸量器
3.      超纯水
4.      用于样品准备的其它器材
 
储存条件和稳定性
此试剂盒需按指定要求储存于-20℃,并在有效期内使用,有效期见盒外
 
实验前准备
缓冲液制备
所有缓冲液贮存在4℃至2个月
EIA缓冲液准备
将1支EIA缓冲液(编号:400060)加90 ml超纯水进行稀释.确保冲洗掉瓶内盐类沉淀物.
洗涤液准备
用2L的超纯水稀释5 ml400倍浓缩的洗涤液(96T试剂盒,编号:400062),同时加入1 ml吐温20(编号:400035) 或者 用5L的超纯水稀释12.5 ml400倍浓缩的洗涤液(400T试剂盒,编号:400062), 同时加入2.5 ml吐温20(编号:400035)
提示:由于吐温20是粘性液体,所以不能用常规的移液管移液.需用位移移液管与注射器进行定量.
 
样品准备
一般情况下,尿液和组织上清液可用缓冲液稀释,然后直接加入微孔内。血浆,血清,全血和组织匀浆和其他非均匀的基质可能会含有感染实验的杂质,在进行大量样品检测时是先进行干扰检查。进行干扰检测试验时,稀释1到2个检测样品,每个样品两个不同的稀释比例,如果在zui后的cGMP浓度计算中两个不同稀释比例的样品具有良好的相关性,则不需纯化,否则需进行纯化。由于多数样品中都会含有磷酸二酯酶,样品纯化强制酶对cGMP的水解。
 
血浆(血清)纯化
500ul的血浆加上2ml的冰乙醇混匀,室温下放置5min,1500xg下离心10min以除去沉淀,将上清移至另一10ml的干净试验管。在真空离心机中或者氮气气流中干燥上清液,然后再加入500μl的EIA缓冲液溶(离心机能用来干燥提取物中的水分),确保所乙醇已经除尽以免微量的乙醇影响检测结果。
 
培养基样品
组织和细胞上清无需纯化可直接用于试验。如果样品中的cGMP浓度足够高则需用缓冲液进行10倍的稀释,试验操作无需进行任何改动。当样品低浓度时(样品无需缓冲液稀释),稀释同一培养基中的标准曲线,以达到样品和标准品基质达到相符合。我们建议要首先建立标准曲线以确保在特殊的样品中试验也可进行。
细胞液抽提
1.    提出培养基
2.    每35cm2表面区域加入1ml的0.1M的盐酸
3.    室温下孵育20min
4.    用刮刀将细胞从表面刮落
5.    用移液枪吹打混匀直至上清均匀,转移至合适的离心管内
6.    1000xg
这些上清可直接用于试验
 
组织样品
7.    组织中的循环核苷酸会立即分解,所以下离心10min
1.    上清倒入另一干净试验管内采样后应将其立即冰冻
2.    冰冻组织称量,滴加5-10个单位(液体/ml,组织/g)的TCA,用匀浆器将样品混匀。
3.    1500xg下离心10min,去除沉淀,将上清移至另一干净试验管
4.    用水-饱和乙醚从样品中抽提TCA。5体积的乙醚和1体积的上清,混合10秒,萃取分离,去除上层,重复抽提两次以上。
5.    通过在70℃下加热样品以除去剩余的乙醚。
组织中提取的上清无需稀释可直接用于试验,标准曲线基质液的准备,抽提10ml 用乙醚处理过的5%的TCA,通过加热除去剩余的乙醚,剩下的溶液检测得标准曲线。
 
特异性试剂的制备
cGMP  AChE示踪液
100dtn cGMP  AChE示踪液与6ml的缓冲液
或500 dtn cGMP  AChE示踪液与30ml的缓冲液
配制的cGMP示踪液应储存在4℃下,4周内有效
示踪染料:加入染料可辅助目测观察,在配制好的示踪液中加入染料(60ul的染料加入到6ml的示踪液中或是300ul染料和30ml的示踪液)
cGMP抗血清
100dtn cGMP抗血清与6ml的缓冲液
或500 dtn cGMP抗血清与30ml的缓冲液
配制的cGMP抗血清应储存在4℃下,4周内有效
抗血清染料:加入染料可辅助目测观察,在配制好的抗血清中加入染料(60ul的染料加入到6ml的抗血清中或是300ul染料和30ml的抗血清)
无乙酰化的标准品和样品的准备
1ml的缓冲液配制cGMP标准品,终浓度为300 pmol/ml,贮存在4℃下,可保存6周。
标准品准备:准备8个干净试管,标号,吸取900ul缓冲液至1号管,2-8号管加500ul缓冲液,吸取100ul bulk标准品(300 pmol/ml)至1号管,混匀,从1号管吸取500ul至2号管,混匀,依次进行稀释。稀释的标准品贮存时间不能超过24h
如图
样品的准备:如果样品需要纯化,则根据纯化步骤完成,如无需纯化,则无需进一步制备。但是样品需要稀释来确保其浓度保持在标准曲线的线性误差范围内(20%-80%B/Bo)
 
标准品和样品的准备----乙酰化
标准曲线的准备
用1mlEIA缓冲液重组标准cGMP,吸取100μl标准A到9.9ml的EIA中,此标准品的浓度是3pmol/ml
注意 如果样品利用组织萃取法提取TCA,且不能用至少1:5的EIA来分析,利用乙醚萃取法提取TCA来准备标准曲线。任何稀释的样品需要按此方法进行
用EIA准备标准曲线: 取9个干净试管依次编号#0至#8,吸取900μl到#0(只含有buffer),#2至#8加入500μlEIAbuffer,吸取1ml标准B(3pmol/ml)到#1 ,然后吸取500μl到#2中稀释,混匀后,从#2中吸取500μl到#3中,混匀,以此类推,至#8,稀释液保存不能超过24小时
样品准备
如果样品需要纯化,则在乙酰化之前进行纯化(操作参照12-14的纯化操作),虽然纯化不是必需的,但我们建议将样品纯化以确保试验的完整性。如果乙酰化的样品少于500μl,必须加入一定体积的KOH,和适量的无水醋酸。
 
KOH准备
配置4M的KOH溶液,溶解100dtnKOH到10ml的超纯水或者500dtn到50ml的超纯水中
乙酰化步骤(建立在500μl体系中)
#0-#8中所有的标准样品必须乙酰化,每一个样品/标准品都必须单独的乙酰化。确保在同一条件下进行乙酰化是很重要的,混合时间的不同或者是加入KOH的时间有误都会影响试验结果。
500μl的样品,快速加100μl 4M KOH和25μl的无水醋酸,混匀器中混匀15s,加入25μl 4M KOH并混匀,对其余样品重复相同的操作。
注意 如果样品含糖量>250mM,则应该增加合适的KOH和无水醋酸的体积,以确保乙酰化的完全反应。
 
一般注意事项
检测前样品禁用有机溶剂进行预处理
样品采集后需立即检测,但在-80℃冻存的样品需解冻,不可立即检测.
建议布板如下:
 (可根据实验的实际情况调整布局)
注释:每块板条都含用2个空白对照孔(Blk),2个非特异性孔(NSB),2个zui大值孔(B0). 8个标准品孔(双份),如下图所示:
实验步骤
A.试剂的加入
1.EIA缓冲液
加100 µl EIA缓冲液到非特异性包被孔中(NSB),加50 µl到zui大值孔中(B0).如果加入培养基样品是为了稀释标准曲线的,在非特异性包被孔(NSB)中和zui大值孔(B0)加50µl培养基样品,另加50 µl EIA缓冲液至NSB孔中.
2.标准品
加试管#8的50µl标准品至S8孔中.再加试管#7的50µl标准品至S7孔中.依次加入各标准品入相应的孔中.
3.样品
依次加50µl样品于相应各孔中,每个样品至少有两个稀释比例.每个稀释比例都做平行样
4.酶联物
加50µl酶联物于相应各孔中(TA孔和Blk孔除外)
5.cGMP抗血清
加50µl抗血清于相应各孔中(TA孔和NBS孔,Blk孔除外)

微孔
缓冲液
标准品/样品
示踪物
抗体
Blk
-
-
-
-
TA
-
-
5ul
-
NSB
100ul
-
50ul
-
B0
50ul
-
50ul
50ul
Std/Sample
-
50ul
50ul
50ul

 
B.反应板的孵育
用塑料薄膜(编号:400012)盖板在室温下孵育18h(或在4℃下孵育18h,可些许增加试验灵敏度)
C.试验继续
1.临使用前复溶Ellman’s试剂(20ml的试剂足够加100个试验孔)。1支100dtn的Ellman’s试剂(Cat.400050)用20ml的超纯水复溶。注意:复溶Ellman’s试剂不稳定,只能即配即用且避光储存。
2.弃去反应孔中的反应液,用洗液洗5次。
3.每个反应孔加配制的Ellman’s试剂200ul.
4.加5ul示踪试剂至TA孔内。
5.用塑料胶片盖板,在振荡器上振荡反应60-90分钟,若在4℃,则时间约为90-120分钟。
D.读板
1用干净的纸巾擦去板条底部的指纹.
2移去塑料薄膜,但避免Ellman试剂溅射
3在405-420nm处读数.建议当B0孔的读数在0.3-1.0  AU(减去空白孔后的值)范围时才读取样本值.如果各孔的值超过1.5则应洗板,加入Ellman试剂再孵育
重测.
结果计算
1.      NSB孔的OD均值
2.      B0孔的OD均值
3.      B0均值减去NSB均值,这就是校正的B0或是校正的zui大结合量
4.      计算剩下微孔的%B/B0(%样品或标准品结合量/zui大结合量)值,S1的吸收值减去NSB的吸收均值,然后除以校正B0值,乘以100即得到了%B/B0,
按此法重复计算剩余的标准品和样品。
标准曲线的绘制
以标准品的%B/B0值为Y轴和cGMP的浓度为X轴绘制曲线,将数据代入到四参数方程式
计算每一个样品的%B/B0值,根据标准曲线的方程式来计算样品的浓度。样品%B/B0值大于80%或小于20%则视为超出了标准曲线的线性范围,需重做,同一样品的不同稀释比例得到的结果相差甚大,则表明有感染,需纯化。
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