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苯丙氨酸(PKU)检测试剂盒说明书
苯丙氨酸(PKU)检测试剂盒说明书
德国IBL进口原装,酶标仪定量检测
德国IBL中国*代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务
 
中国SFDA注册:国食药监械(进)字2010第3402924号
产品标准编号】YZB/GEM 1401-2010
 
产品名称
通用名称:苯丙氨酸检测试剂盒
商品名称:苯丙氨酸检测试剂盒
英文名称:Phenylalanine (PKU) neonatal Screening Assay
 
包装规格】480人份/盒
 
预期用途
此试剂盒可用于新生儿血斑中L-苯丙氨酸的体外定量检测。仅供新生儿苯丙酮尿症的筛查。
苯丙酮尿症(PKU),是一种zui常见的氨基酸代谢遗传病,它通过常染色体隐性遗传给子代,在人群中的发病率为1/2600—1/25000。
发病的主要原因(90—99%病例)是苯丙氨酸羟化酶的活性降低或缺失。苯丙氨酸羟化酶可以使必需氨基酸苯丙氨酸转化为酪氨酸,后者是儿茶酚胺、黑色素和甲状腺激素的前体,由于苯丙氨酸这个代谢的阻断,因而通过旁路代谢转化为苯丙酮酸和乙酸盐,通过肾脏排泄。
    该疾病由于在出生后*周,病人代谢抑制就表现出来。因为蛋白质代谢的改变引起大脑神经纤维异常的髓鞘形成对疾病的发展起主要作用。苯丙酮尿症的其它表现有(和附属物)色素沉着的缺乏。是因为黑色素形成的紊乱,因而引起皮肤病。
在新生儿中对苯丙酮尿症的诊断是重要的,因为可通过低苯丙氨酸膳食避免脑损害。因而测定血中苯丙氨酸浓度的筛查试验,应在出生后3—5天进行,假如为阳性,应通过检测染色体特异的突变来进行确证试验。
为了检验苯丙酮尿症病人发展了许多筛查试验,zui早的试验是由GUTHRIE 发明命名的,以枯草杆菌的生长习性来检测,枯草杆菌只能在高苯丙氨酸浓度生长。因为该方法的许多缺陷被其它的一些试验替代,这些实验是利用病人血液中的苯 丙氨酸参与的化学反应,利用荧光或显色底物,进行测定。也可以应用更可信、更灵敏、更的高压液相色谱检测。
 
检验原理
将血斑纸上的苯丙氨酸用3%的三氯乙酸从滤纸上洗脱。
样本中的苯丙氨酸在外加苯丙氨酸脱氢酶的作用下转化成苯丙酮酸盐,此反应使存在于反应混合物中的辅酶NAD+再生。产生的NADH 使加入的黄色Tetrazalium 盐发生氧化还原反应生成紫色物质Formazane,在570nm波长测定OD值,OD值与病人样本中的苯丙氨酸浓度成正比。
 
主要组成成分
1、试剂盒成分
RE80015
标签
成分
ENZ LYO
酶,冻干粉,内含苯丙氨酸脱氢酶,辅酶NAD+,缓冲掖,稳定剂
1×45ml
ENZDIL
酶稀释液,即用,内含二乙醇胺,缓冲液,0.01%的NaN3
1×55ml
SUBS
底物,即用,内含四唑盐和柠檬酸盐。
1×5
CAL A-E
标准品A~E:1;3;6;12;18mg/dl,用2.EWS进行校准。内含人血液,Schleicher & Schuell滤纸编号:903.15血斑纸片。具体浓度请见试剂瓶标签或质控单。
1×2
CONTROL 1+2
质控品 1+2
质控品1:1.8-3.0mg/dl  
质控品2:4.0-6.0mg/dl
内含人血液,Schleicher & Schuell滤纸编号:903.15血斑纸片。具体浓度及可接受范围请见试剂瓶标签或质控单
1×2ml
DYE CONC
显色储存液,51倍浓缩型,内含酸性黄23(C.I.19140)
 
2、实验需要但试剂盒不提供器材
1)移液器(多道移液器或类似仪器:<3% CV),体积:25;75;100;600;1000ul。
2)圆底聚苯乙烯试管(12×75mm)
3)试管架
4)试管振荡器
5)三氯乙酸(3%;w/v),用99.5%的三氯乙酸配得
6)0.5M的NaOH溶液
7)血液采集纸片(建议使用Schleicher & Schuell 903)
8)血斑打孔器,5mm(1/5´´)(例如:Sauer,Hannover,Germany)
9)微孔板(平底)
10)            微孔板振荡器(300-500rpm,振幅:1.5-3.0mm)
11)            可在570nm读数的酶标仪(参比波长:690nm)
12)            双蒸水或去离子水
13)            吸水纸,取样吸头和计时器
 
储存条件及有效期
试剂盒应当储存于2-8℃的环境下,避免太阳直射,有效期内稳定。样品的储存与稳定及试剂的准备将在相关单元中说明。有效期见试剂盒标签。
 
使用仪器】通用酶标仪(配有570nm滤光片)
 
【样本要求】
血斑
应当从婴儿足跟的中部或内测收集足跟血,注意血液采集的常规注意事项.刺破足跟后,*滴血应当用消毒纱布擦去.将采集卡对准血滴,让足量的血渗入到吸水纸上并充分填满预先印好的圆圈。重复操作,将所需数目的血斑都制备好。将血斑室温下凉干3小时,避免太阳直射。
注意
因为标准品是用Schleicher & Sshcuell No. 903滤纸确定的,所以滤纸的材料会影响实验结果,我们建议您也使用Sshleicher这种纸片。采血时请勿挤压穿刺部位,因为挤压会早成溶血或组织液 稀释血液。不要在采血圈内连续滴血。请勿接触或涂抹血斑。确保血斑样品看上去符合实验要求(例如:血无涂抹,无凝块,血斑上无指纹)。
注意
样品应当在婴儿出生后第三天到第五天的时间内采集。(出生后72到120小时内)。出生不到72小时就采集的样品可能产生假阴性结果。
储存
2-8℃
避免热源和太阳直射
稳定性
6个月
 
【检验方法】
1、实验准备
(1)酶储存液的准备
注意
配置好的酶储存液在2-8℃可稳定存放5天。准备实验实际所需要的酶反应液即可。
 
在每支冻干的酶试剂瓶内加入12ml双蒸水,盖好试剂瓶,轻轻混合以使其充分溶解,混合2分钟,混合时避免起泡。
 
(2)酶溶液的准备
注意
如果您使用了好几支酶储存液,我们建议您将各管稀释液混合并确定混合液的浓度.重新配置好的酶储存液在18-25℃可稳定存放8小时,储存于2-8℃的环境下也不能延长它的有效期
 
酶溶液的建议配制量:
反应板数
1/3
2/3
1
2
3
4
5
酶储存液(mL)
0.8
1.6
2.4
4.8
7.2
9.6
12
稀释液(mL)
2.7
5.3
8.0
16
24
32
40
 
按照上述表格用稀释液稀释酶储存液,充分混合2min,混合时避免起泡
 
(3)有色三氯乙酸(3%)的准备
 
用3%三氯乙酸按1:51的比例稀释显色储存液(如:加2ml浓缩型的染色储存液到100ml3%的三氯乙酸中。配置好的三氯乙酸在18-25℃的环境下有效期内稳定。
 
(4)血斑的洗提
 
用打孔器打下标准品、质控品和样品血斑纸片(直径5mm),分别放到相应的聚苯乙烯试管中,标上标签
 
在每一试管中加入100ul 3%三氯乙酸,确保每一纸片都被溶液浸没。
 
振荡器(300-500rpm,振幅:1.5-3mm)上室温(18-25℃)温育30-60分钟。
 
2、实验步骤
1
在微孔板的每一微孔中加入25ul 0.5M的NaOH溶液。
2
将75ul标准品、质控品和血斑样品洗提液分别加入到相应的微孔中,稍振板以便混合均匀
3
在每一微孔中加入100ul临时配置好的酶溶液
4
室温(18-25℃)下温育30分钟
5
在每一微孔中加入100ul底物溶液,振荡器(300-500rpm,振幅:1.5-3mm)上振荡3分钟
6
加入底物后3-5分钟内570nm处读取OD值
 
【参考值(参考范围)】
 
 
 
【检验结果的解释】
1、结果计算
以标准品的OD值为Y轴(线形)对标准品的浓度为X轴(对数)做一条标准曲线,标准曲线可用线形回归曲线来做。用计算机自动计算时,用2点线形 回归方程得到的曲线。计算回归曲线时,用每一个标准品的数值来画标准曲线(数值明显偏离的应当忽略不要,并使用更接近的数值来做标准曲线)。样品的浓 度可以从标准曲线上直接读取。样品所显示信号高于zui高标准品的必须用参考方法进行确认。
转换系数:1mg/dl=60.5μmol/L
 
典型标准曲线(范例,请勿用其定标)
标准品
苯丙氨酸(mg/dl)
平均OD值
A
0.61
0.039
B
2.61
0.074
C
5.81
0.108
D
11.61
0.186
E
17.61
0.283
 
2、结果说明
如果血斑样品中苯丙氨酸的浓度高于3.3mg/dl(=平均值+3倍的标准差)的样品认为是“假阳性”样品,如果苯丙氨酸的期望值呈正态分布的 话,则3%的受检人群必须重复检测。如果再次检测的结果仍高于3.3mg/dl,则应当再采集新样品并用证实实验分析。关于新生儿筛查的各种团体都建 议:TSH的重复检测应使用不同的临界值,而且应当应用证实实验。鉴于每个实验室都使用不同群体的新生儿样品,我们强烈建议每个实验室确定自己实验室的正 常值范围,而且其数值分布应当与当地相应社会团体的建议数值一致。实验结果本身仅仅是确定治疗结果的一个因素,它必须与临床症状及诊断检测相结合。
 
【检验方法的局限性】
样品的采集对实验结果有明显的影响,具体如何采集样品请见“样品的采集与储存”。
筛查检测中,血斑中苯丙氨酸浓度提高的结果都被认为是“假定阳性”样品,应当再次取样并重新检测。不能完全排除实验中出现假阴性结果的可能。有 苯丙酮尿症既往病史或临床症候的样品应当重复检测。如果苯丙酮尿症的病人接受了药物治疗,那么我们不能排除药物对苯丙氨酸结果的直接影响。因此,在上述那 些情况下,如果病人有苯丙酮尿症的既往病史或临床征候,我们强烈建议您用证实实验确定正常的苯丙氨酸值。建议血斑样品取样时使用S&S903滤纸 片。如果使用其它的滤纸片,应当考虑其相应的矫正因子。例如,使用2992滤纸片会使结果产生20%的不同:标准品(2992)=1.2×(S& S903)+0.181;相关系数=0.996;数量=349
至于交叉反应,请见“产品性能指标”。
如下血液成分浓度高于下述浓度时对实验结果会产生明显影响(±15%):
血红蛋白
5mg/dl
胆红素
500mg/dl
甘油三酯
3000mg/dl
 
【产品性能指标】
分析特异性(交叉反应)
用有交叉反应的典型物质检测,没发现有交叉反应
灵敏度分析(检测极限)
1.55mg/dl
灵敏度分析:20%;y=26.33×-0.6304 R2=0.82
精密度
范围(mg/dl)
CV(%)
 
            板内差异
2.68-9.6
5.8-11.0
 
            板间差异
2.79-9.36
6.4-15.1
 
线形度
样品中苯丙氨酸浓度高于zui高标准品的应当用其它参考方法进行证实。样本稀释是不可能的,因为稀释用无苯丙氨酸血不存在。而无苯丙氨酸的血液浸膏剂做稀释液可能会产生基质效应。
重现性
平均值(U/ml)
范围(%)
加入已知浓度样品后的重现性%
101
91-127
与其它实验方法比较
IBL检测=0.88×其他检测-0.21
r=0.95;n=98
 
【注意事项】
1、注意事项与预防措施
1)      试剂仅供体外诊断和专业人士使用。
2)      在检测开始之前,仔细和完整的阅读说明书,使用试剂盒提供的说明书的有效版本,确保所有的程序都清楚。寻求更多信息(比如:临床背景,检测操作,自动化操作说明,可选择的软件,文献等等),请查看IBL公司主页。
3)      如果试剂盒有破坏的请与IBL公司或供应商以书面方式,但自您拿到试剂盒后zui迟不超过一个星期。在检测时请不要使用受损的试剂,以确保自身安全。
4)      按照批号和有效期,不要混合使用不同批号的试剂,也不要使用过期的试剂。
5)      遵守实验室优化管理规则和安全指南,穿实验服,带橡皮手套,有必要时请戴护目镜。
6)      这种试剂盒中含有会伤害眼睛和皮肤的有害试剂,请阅读材料来源和标签获取详细信息。产品的材料安全数据能够从IBL公司主页上下载或直接向IBL公司索取。
7)      根据国家生物有害物质及安全条例,所有化学药品和准备或使用过的试剂都应当做有害物质进行处理。
8)      此试剂中用到的标准品及质控品的人血成分经乙肝表面抗原,抗-HCV抗体,抗-HIV1+2抗体检验结果应为阴性,但是试剂中会出现此类病毒 (HIV/II,HbsAg和HCV)或其他具有感染性的病原体的可能性都不能完全被排除。因此,所有的试剂在使用和处理的过程中都应当作潜在生物有害物 质进行处理。
2、实验操作注意事项:
1)        样品的不合理处理及实验操作的任何改动都将影响实验的结果。取样体积、温育时间、预处理步骤都必须严格按说明进行。只能使用标准取样器和标准设备。
2)        一旦实验开始,所有的步骤都必须完整的进行下去,不允许中断。把所有试剂和样品都拿到18-25℃的实验室中,在使用前,轻轻摇动液体试剂和样品,试剂混合过程中要避免气泡。
3)        请勿接触试剂、取样器、微孔/试管。加试剂和样本时,请使用新的取样吸头,以避免交叉污染。不用的试剂应用盖子盖好,以免重复使用。
4)        为了消除潜在的加样误差,建议每份样品都做双份检测。
5)        用加液记录表格核对反应板上的排列顺序。
6)        温育时间会影响实验结果。微孔加样的顺序和时间都必须一致。建议使用8道移液器向微孔加样。
 
参考文献
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生产企业
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