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人粒细胞集落刺激因子(G-CSF) ELISA试剂盒
人粒细胞集落刺激因子(G-CSF ELISA试剂盒
日本IBL原装进口,货号:27131
日本IBL中国*代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务
简介
G-CSF属于细胞因子类,刺激中性粒前体细胞的分化和增殖,它由成纤维细胞和血管内皮细胞产生,且有报道称,在某些肿瘤内可刺激其增殖。人G-CSF试剂盒可检测人G-CSF
原理
此试剂盒根据酶免法的夹心原理,利用两种不同的高特异性抗体,TMB作为着色剂,颜色强度与人G-CSF的量成正比
检测范围
7.81~500pg/ml(37℃下*次孵育1小时)
1.95~250pg/ml(4℃下*次孵育过夜):内部数据
预期用途
1.       此试剂盒用于细胞上清液中人G-CSF的定量检测
2.       重组的和天然的G-CSF都可以用此试剂盒检测
3.       经验表明,由于全血的干扰,血清或EDTA血浆的稀释比例较低可导致结果更低(见附录一)
试剂盒组成
1.       包被板,96孔,包被有抗人G-CSF鼠IgG单抗,亲和纯化
2.       标记抗体浓缩,30X,0.4mlx1,HRP标记的抗人G-CSF兔IgG Fab’,亲和纯化
3.       标准品,1.0mlx2,重组人G-CSF
4.       EIA缓冲液,30mlx1,1%BSA,含0.05%吐温20的PBS
5.       标记抗体稀释液,12mlx1,1%BSA,含0.05%吐温20的PBS
6.       着色剂,15mlx1,TMB底物液
7.       终止液,12mlx1,1N硫酸
8.       洗涤缓冲浓缩液,50mlx1, 40X,含0.05%吐温20的磷酸缓冲液
实验所需材料但试剂盒未提供
1.       酶标仪(450nm)
2.       移液器和枪头
3.       烧杯
4.       蒸馏水
5.       孵箱(37±1℃)
6.       坐标纸(对数-对数)
7.       吸水纸
8.       标准品稀释管
9.       洗瓶
10.   一次性试验管
准备
1.       洗涤缓冲液制备:先将洗涤浓缩液平衡至室温,充分混匀,然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀,即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内,并于2周内用完
2.       标记抗体的制备:用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍,即得。
例:如果只测一条板,8孔,则需要标记抗体800ul(30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液,混匀,使用时每孔加100ul)
此步骤在实验前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内,保存在4℃
3.       标准品的制备:吸取1.0ml的去离子水至标准品瓶内,充分混匀,得到1000pg/ml的人G-CSF标准品
4.       标准品的稀释:准备8个试管用于标准品的稀释,每管加入230ul的EIA缓冲液
每管的浓度如下
1号管                 500pg/ml
2号管                 250pg/ml
3号管                 125pg/ml
4号管                 62.5pg/ml
5号管                 31.25pg/ml
6号管                 15.63pg/ml
7号管                 7.81pg/ml
8号管                 0pg/ml(试验样品空白)
吸取230ul的标准品于1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管,依次连续稀释,标准品范围为500~7.81ng/ml
 
内部实验步骤(4℃下孵育过夜
高灵敏度所必须的操作步骤
1)  标准品的准备:吸取2.0ml的去离子水至标准品瓶内,充分混匀,得到500pg/ml的人G-CSF标准品
2)  标准品的稀释:准备9个试管用于标准品的稀释,每管加入230ul的EIA缓冲液
每管的浓度如下
1号管                 250 pg/ml
2号管                 125pg/ml
3号管                 62.5pg/ml
4号管                 31.25pg/ml
5号管                 15.63pg/ml
6号管                 7.81pg/ml
7号管                 3.91pg/ml
8号管                 1.95pg/ml
8号管                 0pg/ml(试验样品空白)
吸取230ul的标准品于1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管,依次连续稀释,标准品范围为250~1.95pg/ml,9号管为试验样品空白
5.       样品稀释:样品用EIA缓冲液稀释。如果样品浓度事先没有建立,我们建议,先用几个不同稀释比例的样品进行检测,来确定样品zui佳稀释比例
实验步骤
使用前,所有样品应平衡至室温,大约30min,然后充分混匀,确保试剂质量无变化,标准曲线和样品检测同时进行
如图:
 
1.       Reagent Blank孔内加入100ul的EIA缓冲液
2.       将试验样品空白对照,样品和稀释的标准品加100ul至相应的孔内;(内部操作程序一样)
3.       盖板,37℃下孵育1小时(4℃下孵育过夜)
4.       洗板,重复7次以上,吸水纸上拍干;洗板机则洗板4次
5.       每孔加入100ul的标记抗体液,除Reagent Blank孔外
6.       盖板,37℃下孵育30min
7.       洗板9次,同步骤四
8.       吸取试验所需的TMB底物液于一次性试管内,每孔加入100ul的TMB底物液。剩余的TMB底物液不能再放回至原装瓶内,避免污染
9.       黑暗处,室温下孵育30min,溶液变蓝
10.   每孔加入100ul的终止液,溶液变蓝
11.   擦去微孔板底部的污点或水滴,终止液加入后30min内,在酶标仪450nm处读数
特别注意
1.       试验样品采集后应立即检测,冻存的样品避免反复冻融,检测前应先将其完全溶解混匀
2.       试验样品用EIA缓冲液稀释
3.       试验样品和标准品应做双份检测
4.       试验样品应在中性PH范围,有机溶剂的污染可能会影响检测
5.       只能用试剂盒提供的洗涤液洗板,否则会导致试验失败
6.       吸水纸上拍干微孔板,不能擦拭
7.       TMB底物液应贮存于黑暗处,因其对光敏感,且避免接触金属
8.       加入终止液后30min内必须酶标仪读数
结果计算
绘制曲线前,所有的数据都应减去试验样品空白值,包括标准品和未知的样品。以标准品的OD值和浓度在对数-对数坐标纸上绘制标准曲线,从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度
 
附:采用全自动酶标仪检测,只需检测前设置好酶标仪的相关参数,如坐标参数(线性,半对数)和计算方式参数(三次回归、四参数或双对数曲线方程),即可直接得到结果
附录一:
 
 
本译文仅供参考,详情请以原文为准。
 
 
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