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人淀粉样蛋白770(APP770)ELISA试剂盒

 

人APP770酶免ELISA试剂盒
(日本IBL原装进口,货号:27736)
日本IBL中国*代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务
 
简介
阿尔茨海默病(AD)是典型的老年性痴呆,脑组织内淀粉样蛋白β(Aβ)的累积是造成此病的主要原因,与此同时,患有AD的患者其累积的Aβ90%在脑血管壁上发现。众所周知,是由可分解出两种蛋白(β-和γ-分泌)的淀粉样前体蛋白(APP)产生的,累积在脑组织内的Aβ分子主要是由神经细胞内的APP表达产生,即APP695.与此相反,另一不同APP即APP770,表达于脑血管内皮细胞,报道称,APP770产生的Aβ也在脑血管壁上累积
此ELISA试剂盒用于EDTA-血浆,脑脊髓液和上清中人APP770的检测
实验原理
此试剂盒是一种夹心法的ELISA试剂盒,使用了两种高特异性的抗体。TMB作为显色剂,zui终溶液所显示的颜色强度与样品中APP770的量成正比
检测范围
0.10~6.2ng/mL
预期用途
仅用于研究,不能用于诊断
此试剂盒用于EDTA-血浆脑脊液和细胞上清中人APP770的定量检测
试剂盒组成
1.       微孔板,96T,包被有抗人APP OX2(351)兔子IgG抗体,亲和纯化
2.       标记抗体浓缩,30X,0.4ml,HRP标记的抗人APP(R101A4)小鼠IgG 单抗Fab片段
3.       标准品,0.5ml,2支,重组人APP770
4.       EIA缓冲液,30ml,1%的BSA,含0.05%的吐温20的PBS
5.       标记抗体稀释液,12ml,1%的BSA,含0.05%的吐温20的PBS
6.       着色剂,TMB,15ml
7.       终止液,1N硫酸,12ml
8.       洗涤缓冲浓缩液,40X,50ml,0.005%吐温20的磷酸缓冲液
准备步骤
试验所需材料但试剂盒未提供


 

l         酶标仪(450nm)
l         带刻度的量筒与烧杯
l         孵箱(37℃±1℃)
l         吸水纸
l         稀释试管
l         微量移液器和取样吸头
l         去离子水
l         坐标纸(log/log)
l         用于稀释标准品的试管
l         洗涤瓶
试剂准备
1.       洗涤缓冲液制备:先将洗涤浓缩液平衡至室温,充分混匀,然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀,即得。配制的洗涤液应保存于冰箱内,并于2周内用完
2.       标记抗体的制备:用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍,即得。
例:如果只测一条板,8孔,则需要标记抗体800ul(30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液,混匀,使用时每孔加100ul)
此步骤在实验开始前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内,保存在4℃
3.       标准品的制备:吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内,充分混匀,得到12.4ng/ml的人APP770标准品
4.       标准品的稀释:准备8个试管用于标准品的稀释,每管加入230ul的EIA缓冲液
每管的浓度如下
1号管                 6.2ng/ml
2号管                 3.1ng/ml
3号管                 1.55ng/ml
4号管                 0.78ng/ml
5号管                 0.39ng/ml
6号管                 0.19ng/ml
7号管                 0.10ng/ml
8号管                 0ng/ml(试验样品空白)
吸取230ul的标准品于1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管,依次连续稀释,标准品范围为6.2~0.10ng/ml
5.       样品稀释:样品用EIA缓冲液稀释。如果样品浓度事先没有评估,我们建议,先用几个不同稀释比例的样品进行检测,来确定样品zui佳稀释比例
实验步骤
使用前,所有样品应平衡至室温,大约30min,然后充分混匀,确保试剂质量无变化,标准曲线和样品检测同时进行
 
试剂
检测样品
标准品
检测样品对照孔
试剂对照孔
检测样品100ul
稀释标准品(1-7管)100ul
EIA缓冲液(第8管) 100ul
EIA缓冲液100ul
盖板,4℃下温育过夜
洗板7次
酶标抗体
100ul
100ul
100ul
-
盖板,37℃下温育30min
洗板9次
显色剂
100ul
100ul
100ul
100ul
室温避光温育30min
终止液
100ul
100ul
100ul
100ul
加终止液后30min内450nm处读取OD值
1)  确定好空白对照孔,并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。
2)  确定好样品对照孔,检测样品孔和标准品孔,然后分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。
3)  盖板,4℃下温育过夜
4)  用洗涤瓶洗板,在微孔中加入洗涤液浸泡15-30秒,弃去洗涤液。重复7次,zui后在吸水纸上拍干。如果是用洗板机洗板时,用洗板机洗四次后,再用洗涤瓶洗3次。
5)  每孔加100ul酶标抗体,除试剂空白对照孔外
6)  盖板,37℃下温育30min
7)  按照步骤4)洗板9次
8)  将所需量的显色剂加入到试管中,然后在每一微孔中加入100ul显色剂。为了避免污染,请勿将剩余试剂在倒入原装试剂瓶中。
9)  室温避光温育30min,加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
10)在每孔加100ul终止液,此时溶液颜色会变成黄色
11)擦去微孔板底部的污点或水滴,终止液加入后30min内,在酶标仪450nm处读数
特别注意
1.       试验样品采集后应立即检测或是冻存,冻存的样品避免反复冻融,检测前应在低温下先将其完全溶解混匀
2.       试验样品用EIA缓冲液稀释
3.       试验样品和标准品应做双份检测
4.       试验样品应在中性PH范围,有机溶剂的污染可能会影响检测
5.       只能用试剂盒提供的洗涤液洗板,否则会导致试验失败
6.       吸水纸上拍干微孔板,不能擦拭
7.       TMB底物液应贮存于黑暗处,因其对光敏感,且避免接触金属
8.       加入终止液后30min内必须酶标仪读数
结果计算
绘制曲线前,所有的数据都应减去试验样品空白值,包括标准品和未知的样品。以标准品的OD值和浓度在对数-对数坐标纸上绘制标准曲线,从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度
 
附:采用全自动酶标仪检测,只需检测前设置好酶标仪的相关参数,如坐标参数(线性,半对数)和计算方式参数(三次回归、四参数或双对数曲线方程),即可直接得到结果
 
 
本译文仅供参考,详情请以原文为准。
 
 
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