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人α–klotho ELISA Kit

人α–klotho ELISA Kit

(人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒)

日本IBL原装进口,货号:27998
日本IBL中国*代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务

 

人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

前言简介
α–klotho是经基因改造(类似患有人衰老症状)小鼠体内的一种负调节基因,其基因序列存在多个种属,包括基于小鼠研究的人类,α–klotho蛋白是一种分子量约为130kDa的横跨膜蛋白,在肾脏和甲状旁腺内表达.
近年来,已证实α–klotho是机体调节矿物质代谢的重要因子,如钙和磷的代谢.因此认为,小鼠幼龄老化症状就是因为α–klotho的缺失导致矿物质稳态破坏而引起的. 同时,据报道,构成α–klotho蛋白序列主要部分的长N-端胞外域可经分离释放至血液.然而对于可溶性α–klotho蛋白发挥的功能和变化仍存很多疑点,所以急需研制一套α–klotho检测系统
此ELISA试剂盒可用于检测人血液的α–klotho蛋白
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

实验原理
此固相ELISA试剂盒基于夹心法原理,利用两种不同的高特异性抗体,TMB作为底物显示剂,显色强度与人可溶性α–klotho的量成正比
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

检测范围
93.75~6000pg/mL
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

预期用途
此试剂盒可用于血清,血浆和尿液中人可溶性α–klotho的定量检测
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

试剂盒组成
 

  1. 包被板: 包被有抗人可溶性α–klotho(67G3)小鼠IgG单抗,亲和纯化      96T x 1
  2. 浓缩标记抗体

: (30X) HRP标记的抗人可溶性α–klotho小鼠IgG Fab’亲和纯化              0.4ml x1
 

  1. 标准品: 重组人可溶性α–klotho                                         0.5mlx2
  2. EIA缓冲液:                                                           30mlx1
  3. 标记抗体稀释液: 1%BSA,含0.05%吐温20的PBS                          12mlx1
  4. 显色剂:TMB底物液                                                    15mlx1
  5. 终止液: 1N硫酸                                                       12mlx1
  6. 浓缩洗涤缓冲液: (40X)含0.05%吐温20的磷酸缓冲液                       50mlx1

人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

实验所需材料( 但试剂盒未提供)
酶标仪(450nm)      微量移液管和加样枪头
量筒和烧杯            去离子水
吸水纸                坐标纸
标准品稀释管           洗瓶
一次性试管
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

试剂准备
 

  1. 洗涤缓冲液的准备:

先将(40X)洗涤浓缩液平衡至室温,充分混匀,取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀,即得. 稀释洗涤液应保存于冰箱内,2周内用完
 

  1. 酶标记抗体的准备:

用标记抗体稀释液将标记抗体稀释至30倍,即得
例:如果只测一条板,8孔,则需要标记抗体800ul(30ul的标记抗体+870ul的标记抗体稀释液,混匀,使用时每孔各加100ul)
此步骤应在标记抗体使用前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内,于4℃保存
 

  1. 标准品的准备:

吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内,充分混匀,得到12000pg/ml的人可溶性α–klotho标准品
 

  1. 标准品的稀释:

准备8个试管用于标准品的稀释,各加230ul的EIA缓冲液, 配制成以下8管浓度
1号管                 6000pg/ml
2号管                 3000pg/ml
3号管                 1500pg/ml
4号管                 750pg/ml
5号管                 375pg/ml
6号管                 187.5pg/ml
7号管                 93.75pg/ml
8号管                 0pg/ml(试验样品空白)
吸取230ul的标准品于1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管混匀,如下图所示,按此规律稀释,标准品范围为6000~93.75pg/ml. 8号管作为样品空白,浓度为0pg/ml.

 

  1. 样品稀释:

根据要求,用EIA缓冲液稀释样品.血清,血浆或尿液样品建议稀释2~4倍
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

实验步骤
使用前,将所有试剂应平衡至室温,大约30min,充分混匀,确保试剂质量无变化,标准曲线和样品检测同时进行.
 

试剂 检测样品 标准品 样品空白 试剂空白
检测样品100ul 稀释标准品(1-7管)100ul EIA缓冲液(第8管)100ul EIA缓冲液100ul
盖板,于室温下温育60min
洗板7次
酶标抗体 100ul 100ul 100ul -
盖板,于室温下温育30min
洗板9次
显色剂 100ul 100ul 100ul 100ul
室温避光温育30min
终止液 100ul 100ul 100ul 100ul
加终止液,30min内于450nm处读取OD值

 
  • 设试剂空白对照,并于相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液
  • 确定好样品空白对照孔,检测样品孔和标准品孔,分别将100ul样品对照品、检测样品和稀释好的标准品加入到相应的微孔中。
  • 盖板,室温下温育60min
  • 用洗涤瓶洗板,在微孔中加入洗涤液浸泡15-30秒,弃去洗涤液。重复7次,zui后在吸水纸上拍干.

如用洗板机洗板4次,需再用洗瓶洗板3次
 

  • 除试剂空白对照孔外,每孔各加100ul酶标抗体
  • 盖板,室温下温育30min
  • 按照上述步骤4)洗板9次
  • 用一次性试管取所需量的显色剂,各加100ul显色剂于微孔中.为了避免污染,勿将剩余试剂在倒回试剂瓶中
  • 室温避光温育30min,加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
  • 每孔各加100ul终止液,溶液颜色会变成黄色
  • 擦去微孔板底部的污迹或水滴,确保微孔内溶液无气泡.加入终止液后30min内于酶标仪   450nm处读数

特别注意
 

  1. 试验样品采集后应立即检测或冻存,避免反复冻融样品,检测前应在低温下先将其完全溶解混匀

尤其是尿液样品,温度和冻融对其比血浆或血清稳定性影响更大,所以样品采集后应立即冻存,避免重覆冻存
 

  1. 试验样品根据所需,用EIA缓冲液稀释
  2. 建议各试验样品和标准品做双份检测
  3. 试验样品应在中性PH范围,有机溶剂的污染可能会影响实验结果
  4. 只能用本试剂盒提供的洗涤液洗板,不充足的洗涤会导致试验失败
  5. 用吸水纸拍干微孔板,避免刮擦
  6. TMB底物液应贮存于黑暗处,因其对光敏感,且避免接触金属
  7. 加入终止液后,30min内必须读数

 
 
 
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

结果计算
绘制标准曲线前,所有的数据(包括标准品和未知的样品)都应减去试验样品空白值.以标准品的浓度及相对应OD值,在坐标纸上绘制标准曲线,从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度
 

此标准曲线仅供示例演示,不能用于获取试验数据.每次检测都应建立其标准曲线.
 
 
人α–klotho ELISA Kit
人可溶性α–klotho蛋白检测试剂盒

 
 
本译文仅供参考,详情请以原文为准。
 
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