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生长激素释放因子ELISA试剂盒

生长激素释放因子ELISA试剂盒
(美国DRG原装进口,货号:EIA3429 )
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预期用途

此试剂盒基于竞争酶免法检测特异性多肽和相关多肽。
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实验原理美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。
微孔板预包被有第二抗体,非特异性结合位点封闭,主要抗体的Fab片段竞争结合生物素标记的多肽和标准品或样本中的目的多肽,二抗则与Fc片段结合。生物素标记的多肽与HRP-链霉亲和素反应,催化底物反应,黄色强度直接与生物素标记多肽-HRP-链霉亲和素复合物的量成正比,但是与标准品或样本中的多肽量成反比。根据已知浓度建立标准曲线,样本中未知浓度的多肽浓度可直接从标准曲线上读取。
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试剂盒组成美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。
 

  1. 20X的缓冲浓缩液,50ml
  2. 微孔板,96孔
  3. 封板纸
  4. 主要抗血清,兔抗多肽IgG,1支
  5. 标准品,1支
  6. 生物素标记多肽,1支
  7. HRP-链霉亲和素,30ul
  8. 阳性质控,2支
  9. 底物液,12ml
  10. 终止液,2N盐酸,15ml
  11. 坐标纸
  12. 说明书

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实验所需材料但试剂盒未提供美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。

 

  1. 酶标仪(450nm)
  2. 振荡器,300-400rpm
  3. 洗板系统
  4. 多通道移液器,50-100ul
  5. 溶液贮存瓶
  6. 吸水纸
  7. 采血管(可选)
  8. 抑肽酶,0.6TIU/ml血液(可选)
  9. 缓冲液A(可选)
  10. 缓冲液B(可选)
  11. C18分离柱

注意:打开试剂和试验开始前先将其平衡至室温(20-23℃),强烈建议稀释过的溶液尽快使用,采血步骤见盒子内的采血说明书,每个盒子所含成分足够用于96人份检测或40人份的双孔检测。
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实验步骤美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。
 

  1. 实验前认真阅读说明书,所有试剂平衡至室温(大约25-45min)
  2. 用950ml的去离子水稀释20X的缓冲浓缩液,得到1X的试验缓冲液,用于稀释其他试剂和样本。注意:如果20X的缓冲液出现了结晶,可在水浴锅内加热使其完全溶解,使用前彻底混匀
  3. 用1X的缓冲液稀释,离心标准品,振荡。Stock solution的浓度为1000ng/ml,室温下放置至少10min,至完全溶解。使用前离心,振荡。美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。

标准品准备如下美国DRG中国*代理,。 美国DRG中国*代理,。
编号          标准品的量            缓冲液的量             浓度
Stock           1000ul                ----                    1000ng/ml
#1             100ul的Stock          900ul                  100 ng/ml
#2             100ul的#1             900ul                  10 ng/ml
#3             100ul的#2             900ul                  1ng/ml
#4             100ul的#3             900ul                  0.1 ng/ml
#5             100ul的#4             900ul                  0.01 ng/ml

 

  1. 用5ml的1X的缓冲液稀释主要抗体,放置至少5min,至完全溶解,彻底混匀
  2. 用5ml的1X的缓冲液稀释生物素标记多肽,放置至少5min,至完全溶解,彻底混匀
  3. 200ul的1X缓冲液稀释质控,放置至少5min,至完全溶解,彻底混匀
  4. 将A1和A2孔作为空白对照(Blank
  5. 在B1和B2孔内加50ul的1X缓冲液,作为Total Binding
  6. 将配制好的标准品由#5到#1各50ul依次加入至C1和C2—G1和G2孔内,注意,标准品需做双份检测
  7. H1和H2孔加入50ul已稀释的阳性质控,注意,阳性质控也要做双孔检测
  8. 将50ul样本加入至相应孔内,做双孔检测
  9. 除空白孔外(Blank well),每孔加25ul的已稀释的主要抗体
  10. 除空白孔外(Blank well),每孔加25ul的已稀释的生物素标记多肽,注意,不建议生物素标记多肽或主要抗血清加样时使用多通道移液器
  11. 盖板,室温,300-400rpm下孵育2小时
  12. 在3000-5000rpm下将HRP-链霉亲和素离心5秒,然后取12ulSA-HRP和12ul 1X的缓冲液混匀
  13. 移取盖板,倒去反应液
  14. 每孔350ul 1X缓冲液洗板4次,吸水纸上拍干
  15. 每孔加100ul的SA-HRP
  16. 盖板,室温,300-400rpm下孵育1小时
  17. 移取盖板
  18. 同步骤17)
  19. 每孔加100ul的TMB底物液
  20. 盖板,室温,300-400rpm下孵育1小时
  21. 移取盖板,每孔加100ul的2N 盐酸终止反应。溶液颜色由蓝色变黄色,如未出现统一的颜色变化,用手轻轻拍板,使其彻底混匀,20分钟内进行下一步骤
  22. 酶标仪450nm处读数

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结果计算美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。

在半对数坐标纸上绘制标准曲线。标准品的浓度为X轴,相应的OD值为Y轴,用四参数或对数-对数法绘制zui合适的标准曲线。浓度与OD值成反比关系,随着标准品浓度的增加,黄色强度就减少,即OD值减少
样本浓度可直接从标准曲线上读取。如果样本实验前进行了稀释,则zui后结果应乘以相应的稀释因子
标准曲线为逆向S型曲线美国DRG中国*代理,。 美国DRG中国*代理,。
 
附:采用全自动酶标仪检测,只需检测前设置好酶标仪的相关参数,如坐标参数(线性,半对数)和计算方式参数(三次回归、四参数或双对数曲线方程),即可直接得到结果。美国DRG中国*代理,。
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贮存美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。
 

  1. 收到货后贮存于4℃
  2. 强烈建议尽快使用配制的试剂
  3. 1X缓冲液贮存于4℃
  4. 将不用的微孔板放回至密封袋内密封起来,贮存于4℃
  5. 已稀释的标准品,生物标记物,抗体和HRP贮存于4℃

样本采集的建议美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。
血液采集美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。
用含有EDTA的采血管采集血液,每管可装7ml,采到了抗凝血液后立即摇晃几次,将血液从采血管转至含抑肽酶的离心管,不断摇晃,抑制蛋白酶活性,1600xg转速,4℃下离心15min,,收集血浆,血浆样本可在-70℃下保存1个月。如果采血管可用于离心,可直接将抑肽酶加入至采血管内。美国DRG中国*代理,。
血浆中提取多肽美国DRG中国*代理,。美国DRG中国*代理,。
 

  1. 用等量的缓冲液A酸化血浆,如1ml的血浆加入1ml的缓冲液A,混匀,6000-17000xg下,4℃离心20min
  2. 分离柱内含200mg的C18,依次用缓冲液A(3ml ,3次)和缓冲液B(1ml,1次),使其平衡

注意:步骤3-5中不能对分离柱施加任何压力
 

  1. 将酸化的血浆倒入至预平衡的C18分离柱内
  2. 用缓冲液A(3ml,2次)慢慢洗柱,倒去洗液
  3. 用缓冲液B(3ml,1次)慢慢洗提多肽,收集至塑料管内
  4. 用离心浓缩机或其他方法将洗提液蒸干
  5. 将抽提物直接贮存于-20℃,并尽快进行试验,用1X的缓冲液直接配制。如果多肽浓度不在检测范围内,就直接进行稀释或浓缩

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