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小鼠 CCL8/MCP-2 ELISA 检测试剂盒

小鼠 CCL8/MCP-2 ELISA 检测试剂盒
(日本IBL 进口原装货号:27773 规格:96T)
 

简介
趋化因子(C-C motif)配体8/单核细胞趋化因子2(CCL8/MCP-2)由97个氨基酸组成,属于C-C亚族.CCL8/MCP-2由单核细胞,纤维母细胞和上皮细胞产生,
对CD4+ T细胞,CD8+ T细胞和NK细胞具有趋化活性.尽管CCL8/MCP-2在小鼠体内的生物活性仍存在未知之数,但近期有报告表明,血浆中CCL8/MCP-2浓度上升与移植物抗宿主病(GVHD)的发病有密切,这种病症是一种骨髓移植并发症,并且研究表明CCL8/MCP-2与小鼠机体内的免疫反应息息相关.
 
实验原理
此试剂盒是一种夹心法的酶联免疫吸附测定试剂盒,使用了两种高特异性的抗体。TMB作为显色剂,zui终溶液所显示的颜色强度与小鼠样品中CCL8/MCP-2的量成正比
 
检测范围
78.13 ~5,000 pg/mL
 
预期用途
仅用于研究,不可用于诊断
此试剂盒可用于小鼠血清,EDTA血浆和肝素血浆中CCL8/MCP-的定量检测
 
试剂盒成分
 

  1. 包被板,包被了抗小鼠CCL8/MCP-2(81)兔IgG          96孔
  2. 标记抗体,

30X浓缩,HRP标记抗小鼠CCL8/MCP-2兔IgG单抗,Fab'亲合纯化 0.4ml x 1
 

  1. 标准品,重组小鼠CCL8/MCP-2                0.5mlx 2
  2. EIA缓冲液,1%的BSA,含0.05%的吐温20的PBS       30mlx 1
  3. 标记抗体稀释液,1%的BSA,含0.05%的吐温20的PBS     12mlx 1
  4. 显色剂,TMB,                       15mlx 1
  5. 终止液,1N硫酸,                      12mlx 1
  6. 洗涤缓冲浓缩液,40X浓缩,0.005%吐温20的磷酸缓冲液     50mlx 1

 
实验所需材料但试剂盒未提供
酶标仪(450nm)      移液器和枪头
带刻度的量筒和烧杯     去离子水
冰箱(4℃)         坐标纸(对数/对数)
吸水纸           标准品稀释试管
保温箱(37±1℃)      洗瓶
一次性试管
 
试剂准备
 

  1. 洗涤缓冲液制备:试剂盒的洗涤液为40倍浓缩,使用前,先将洗涤浓缩液平衡至室温,充分混匀,然后吸取50ml浓缩液与1950ml的去离子水混匀,即得。配制的稀释洗涤液应保存于冰箱内,并于2周内用完
  2. 稀释标记抗体的制备:用标记抗体稀释液将标记抗体稀释30倍,即得。

例:如果只测一条板,8孔,则需要标记抗体800ul(30ul的浓缩标记抗体+870ul的标记抗体稀释液,混匀,使用时每孔加100ul)
此步骤在实验开始前完成
剩余的标记抗体浓缩应装于密封瓶内,保存在4℃
 

  1. 标准品的制备:吸取0.5ml的去离子水至标准品瓶内,充分混匀,得到浓度为10,000 pg/mL的小鼠CCL8/MCP-2标准品
  2. 标准品的稀释:准备8个试管用于标准品的稀释,每管加入230ul的EIA缓冲液

每管的浓度如下
1号管                 5,000 pg/mL
2号管                 2,500 pg/mL
3号管                 1,250 pg/mL
4号管                 625 pg/mL
5号管                 312.5 pg/mL
6号管                 156.25 pg/mL
7号管                 78.13 pg/mL
8号管                 0ng/ml(试验样品空白)
吸取230ul的浓度为10,000 pg/mL的标准品至1号管混匀,然后从1号管吸取230ul加入2号管,依次连续稀释,标准品范围为78.13-5,000 pg/mL .8号管为浓度为0 pg/mL

 
 

  1. 样品稀释:样品如需稀释,请用EIA缓冲液稀释,一般情况下,正常小鼠的血清和血浆样品,建议大概稀释倍数为200-500倍.然而,稀释率应视各实验室具体情况优化,因为小鼠CCL8/MCP-2随个体免疫状态和品种等的不同而不同.

 
实验步骤
使用前,所有样品应平衡至室温,大约30min,然后充分混匀,确保试剂质量无变化,标准曲线和样品检测同时进行

试剂 样品 标准品 样品空白 试剂空白
检测样品100ul 稀释标准品(1-7管)100ul EIA缓冲液(第8管)100ul EIA缓冲液100ul
盖板,37℃下温育60min
洗板7次
酶标抗体 100ul 100ul 100ul -
盖板,4℃下温育30min
洗板9次
显色剂 100ul 100ul 100ul 100ul
室温避光温育30min
终止液 100ul 100ul 100ul 100ul
加终止液后30min内于450nm处读取OD值

 
  • 设试剂空白对照孔,并在相应的微孔中加入100ul EIA缓冲液。
  • 确定好样品空白孔,样品孔和标准品孔,然后分别将100ul样品空白(8号管)、检测样品和稀释好的标准品(1-7号管)加入到相应的微孔中。
  • 盖板,37℃下温育60min
  • 用洗瓶剧烈洗板,再在微孔中加入洗涤液静置15-30秒,洒弃洗涤液。重复7次,zui后在吸水纸上拍干

如果用自动洗板机洗板,先自动洗板4次,再按上述手动洗板3
 

  • 每孔加100ul稀释标记抗体,除试剂空白对照孔外
  • 盖板,4℃下温育60min
  • 按照步骤4)洗板9次
  • 取所需量的显色剂加入到试管中,然后在每一微孔中加入100ul显色剂。

为了避免污染,请勿将剩余试剂在倒入原装试剂瓶中。
 

  • 室温避光温育30min,加入显色剂后溶液颜色会变成蓝色
  • 在每孔加100ul终止液,轻敲板边混匀,此时溶液颜色会变成黄色
  • 擦去微孔板底部的污垢或水滴并确定反应液无气泡产生,加终止液后30min在酶标仪450nm处读数

 
特别注意
 

  1. 试验样品采集后应立即检测或是冻存,冻存的样品避免反复冻融,检测前应在低温下先将其完全溶解混匀
  2. 试验样品用EIA缓冲液稀释
  3. 试验样品和标准品建议做双份检测
  4. 试验样品应在中性PH范围,有机溶剂的污染可能会影响检测结果
  5. 只能用试剂盒提供的洗涤液洗板,不充足或过多的洗涤会导致试验失败
  6. 吸水纸上拍干微孔板,不能擦拭
  7. TMB底物液应贮存于黑暗处,因其对光敏感,且避免接触金属
  8. 加入终止液后30min必须于酶标仪读数

 
结果计算
绘制曲线前,所有的数据都应减去试验样品空白值,包括标准品和未知的样品。以标准品的OD值和浓度在对数-对数坐标纸上绘制标准曲线,从标准曲线上可直接读取未知样品的浓度

 
以上典型标准曲线仅供演示说明用,不能用于试验数据的获取,每次试验都应建立标准曲线
 
本译文仅供参考,详情请以原文为准。
 
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