25-OH 维他命D（总）检测试剂盒（酶联免疫法）
（德国DRG*，货号：EIA5396）
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预期用途
此试剂盒用于血清和血浆中总25羟基维他命D（维他命D2和维他命D3）的检测
 
实验原理
此试剂盒基于竞争酶联免疫法
首先，由于体内多数循环25-OH VD 束缚于VDBP，因此结合样本需先经过变性缓冲液的预处理来提取分析物；中和反应后，生物素化的25-OH VD（酶联物）与过氧化物酶标记的链霉亲和素加入，混匀，加入微孔板内，样本中的内源性25-OH VD与25-OH VD-生物素酶联物竞争结合包被板上包被的VDBP，结合的生物素化的25-OH VD由过氧化物酶标记的链霉亲和素检测，孵育，洗板，除去未结合的成分，加入底物液发生颜色反应，一定的时间后加入终止液；颜色强度与样本中的25-OH VD浓度成反比
 
注意事项
 

1. 此试剂盒仅供研究及专业人士使用
2. 试剂盒内所有含有人血清或血浆的试剂都经FDA批准进行了检测，HIV I/II, HBsAg 和HCV都呈阴性；但在使用及处理时还应视潜在生物危险物质
3. 实验前，详细阅读完说明书。使用试剂盒内提供的有效版本说明书，确保理解所有操作步骤

4. 包被板条为可分拆板条。未使用的微孔板放入密封的小袋中，置于2℃- 8℃下存储
5. 按相同的顺序迅速加样品和试剂
6. 每种不同试剂都用单独的容器盛放，特别是底物液。将底物液盛放在曾经保存过酶联物的容器中，会导致变色。切勿将试剂倒回小瓶中，避免污染
7. 为得到*结果，充分混匀微孔中的溶液。别重复使用包被板
8. 实验过程别让微孔静置干燥。各步骤加试剂后，应充分洗板
9. 实验前，将所有试剂平衡至室温（21℃－26℃）。温度会影响实验读数，然而，样品的测量浓度值不受影响
10. 切勿用嘴移液,避免皮肤和黏膜接触试剂和样品
11. 别在样品和试剂处理实验区吸烟，饮食和化妆
12. 处理样品和试剂时,请戴一次性手套.微生物感染的试剂盒样本会导致错误的实验结果.
13. 根据相关国家生物有害物质安全条例或规范操作
14. 别使用过期的试剂, 有效期见标签
15. 严格依据说明书要求，所有试剂的加样量准确。只有使用标准移液管和标准酶标仪才能得到*结果
16. 不要将不同批次的试剂混合使用，也不建议将同一批次的板条进行互换，试剂盒装运或储存的环境不一样也会导致结果有微小的不同
17. 避免接触酸性终止液（0.5 M硫酸），以免灼伤和刺激皮肤
18. 有些试剂盒含Proclin 300, BND或MIT作为防腐剂。如不慎接触眼睛或皮肤，用大量清水冲洗
19. TMB底物液对皮肤和粘膜有刺激作用。如不慎接触眼睛，用大量的清水冲洗，如不慎接触皮肤，用香皂和清水清洗。如不慎吸入，带伤者至空气流通的地方
20. 化学物质和试剂盒必须根据相关国家生物有害物质安全条例或规范进行处理
21. 有关生物危害的详细信息见物料安全数据单, 物料安全数据单可直接向DRG公司获取
试剂盒组成
 

1. 包被板，96孔，可拆，包被了维他命D结合蛋白（VDBP）
2. 标准品（0-5），6瓶，1ml，即用，浓度：0-4-10-25-60-130pg/ml；转换：1 ng/mL = 2.5 nmol/L.标准品根据NIST SRM校准；含无汞防腐剂
3. 高低质控，2瓶，1ml，即用，质控品具体数值及范围见QC指控单，含无汞防腐剂
4. 变性缓冲液，1瓶，10ml，即用
5. 中和缓冲液，1瓶，25ml，即用，含无汞防腐剂
6. 酶联物，1瓶，7ml，即用，生物素化维他命D3，含无汞防腐剂
7. 酶联混合物，1瓶，7ml，即用，链霉亲和素-过氧化物酶，含无汞防腐剂
8. 底物液，1瓶，25ml，即用，TMB
9. 终止液，1瓶，14ml，即用，含0.5M的硫酸
10. 洗涤液，1瓶，30ml，40倍浓缩
11. 盖板，1块

注意：根据需要可额外订购样本稀释用的零标准品
 
实验所需材料但试剂盒未提供
 

1. 用于维他命D释放的玻璃瓶
2. 孵箱37℃
3. 酶标仪（450±10nm）
4. 校准的移液器
5. 吸水纸
6. 去离子水或双蒸水
7. 计时器
8. 半对数坐标纸或数据处理软件

 
贮存条件
未开封的试剂在2-8℃下可保存至有效期，不要使用过期的试剂
开封的试剂和包被板必须贮存于2-8℃，密封袋一旦打开后，应立即密封好
开封的试剂盒若按上述方法保存可保持2个月的活性
 
试剂准备
实验前将所有试剂和试验所需板条平衡至室温
洗涤液
30ml的浓缩洗涤液+1170ml的去离子水混匀，得到1200ml的即用型洗涤液，稀释的洗涤液可在室温下保存2周
 
试剂盒处理
根据相关国家规范处理废弃试剂盒. 试剂盒的特别信息见物料安全数据单
 
损坏的试剂盒
万一试剂盒或试剂成分受到损坏,收到试剂盒zui迟1周以书面形式通知DRG. ，严重受损的试剂组分不能用于实验.
保存受损试剂组分,直至找到好的解决方法. 根据*规范处理损坏组分.
 
样本
此次试验采用血清或血浆（EDTA;肝素；柠檬酸盐血浆）样本
不要使用溶血，脂血，黄疸血样本
注意:不要使用含有叠氮化物的样本
 
样本采集
血清
静脉采血采集全血，立即凝集，室温下离心分离出血清；样本未*凝集前不能离心；接受抗凝剂治疗的病人可能需要更长的凝集时间
血浆
将全血采集至含有抗凝剂的采血管内，离心便可
 
样本贮存和准备
样本采集后盖好盖子，2-8℃下可保存3天；若要保存更长时间，则需冻存于-20℃；避免反复冻融
 
样本稀释
初次试验中，若出现样本的浓度值高于zui高标准，则需将样本进行进一步的稀释，并重新检测，zui终结果应乘以相关的稀释因子
例如：
A）1:10稀释           10ul的血清+90ul的零标准品（充分混合）
B）1:100稀释               10ul  A）1:10稀释的+90ul的零标准品（充分混合）
 
实验步骤
一般注意事项
–使用前，将所有的样品和试剂平衡至室温。试剂混匀，避免产生气泡
–实验开始后，所有步骤应无中断连续进行下去
–使用新的一次性加样枪头，加标准品，质控品，样品，避免交叉污染
–吸光度值是受孵育时间和温度影响。实验前，请准备好所有的试剂，打开瓶盖，保证所需包被板条置于板架上确保所有的加样时间间隔相等，无间断
–一般情况，酶反应与时间和温度成线性相关
 
试验操作
每次实验都应建立标准曲线
所有标准品，样本和质控都做双孔检测；所有的标准品，样本和质控都在同一时间内操作，确保实验环境一致
 
样本预处理步骤
 

1. 将试验所需的玻璃瓶或未包被的包被板固定好
2. 每玻璃瓶加25ul的标准品，质控和样本，每次加样更换新枪头
3. 每玻璃瓶加50ul的变性缓冲液
4. 盖上盖子，37℃下孵育30min
5. 每玻璃瓶加200ul的中和缓冲液
6. 每玻璃瓶加50ul的酶联物
7. 每玻璃瓶加50ul的酶联物混合物
8. 充分混合10秒，充分混合这一步相当重要；然后吸取200ul 此混合溶液用于ELISA试验

 
ELISA 步骤
 

1. 将实验所需板条固定于板架上
2. 加200ul上述已预处理的标准品，质控品和样本于相应的微孔内
3. 盖板，37℃下孵育60min
4. 弃去孔内反应液，每孔加300ul的洗涤液洗板4次，吸水纸上拍干

  注意：试验的灵敏度和度与洗板是否*紧密相关
 

1. 每孔加200ul的底物液
2. 室温下孵育15min
3. 每孔加100ul的终止液
4. 加完终止液后10min内在酶标仪450±10nm处读数

 
结果计算
 

1. 计算各标准品，质控品和样本的吸收值均值
2. 在半对数坐标纸或线性坐标纸上以标准品的浓度为X轴，吸收值为Y轴，绘制标准曲线
3. 以样本的吸收值可从标准曲线上得到相应的浓度值
4. 自动计算方法：说明书中的标准曲线是通过4参数逻辑函数法计算得到，4PL是*方法，其他的方法可能会有些许的偏差
5. 样本浓度可直接从标准曲线上读取；若样本浓度值高于zui高标准品，则需进一步稀释重新检测或结果记录为＞130ng/mL；zui终结果计算时应乘以相关的稀释因子

 
本译文仅供参考，请以原说明书为准
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