欢迎来深圳市科润达生物工程有限公司!我们将为您提供周到的服务!销售热线:86-0755-26814430 15711973608
联系我们Contact us
公司名称:深圳市科润达生物工程有限公司
联系人:科润达客服
地址:深圳市坪山区坑梓中兴路14号中城生命科学园A栋3层
首页 > 技术文章 > 人胎球蛋白A检测试剂盒(酶联免疫法)
人胎球蛋白A检测试剂盒(酶联免疫法)

人胎球蛋白A检测试剂盒(酶联免疫法)
德国DRG*,货号:EIA4522
德国DRG中国*代理商“深圳科润达生物工程有限公司”竭诚为您服务

 
预期用途
此试剂盒可用于血清,血浆,细胞上清,组织提取物和尿液中人胎球蛋白A也称之为α-2-HS糖蛋白的定量的检测;血清或血浆中胎球蛋白A的检测可作为某些癌症及基因遗传缺陷的血清蛋白诊断的辅助工具;此试剂盒仅供实验室专业人士使用
 
简介
胎球蛋白A也称之为α-2-HS糖蛋白,是由两个氨基末端抑制域和一个较小的羧基末端域组成的59 kDa 分子量的糖蛋白;由肝脏合成,分泌至血流,成年哺乳动物体内的浓度范围在0.5-1.0g/L;婴儿期的血清胎球蛋白A含量高,参与蛋白酶抑制活性,与钙代谢和骨生成调节相关;累积于骨和牙齿内,作为生物学上非胶原骨蛋白的主要部分,研究表明,胎球蛋白A是循环中主要的钙化抑制剂;干涉钙盐沉淀;近期研究显示低水平胎球蛋白A的慢性肾脏衰竭患者与心血管病的高死亡率显著相关;另一方面,糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高,这是独立于胰岛素抑制剂的其他标记物;另外,高胎球蛋白A水平还可作为心血管疾病的的危险标记物
 
实验原理
此试剂盒可用于血清样本中人胎球蛋白A的定量检测;采用双位点夹心法,羊抗人胎球蛋白A多抗结合人胎球蛋白A的不同位点
将含人胎球蛋白A的试验标准品,质控品和预稀释样本加至包被了高度亲和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔内,*次孵育,包被抗体捕获样本中的人胎球蛋白A,未结合的蛋白洗板除去,然后加入HRP标记的抗人胎球蛋白A酶联物加入至每孔,“夹心-人胎球蛋白A-HRP-标记的酶联物”形成夹心,未结合的示踪抗体通过洗板除去,结合于包被板上的HRP酶免物与底物液定时反应,然后在酶标仪上检测;结合于包被胎球蛋白A上示踪抗体酶活性与样本中胎球蛋白A的含量直接相关,在点对点或三次回归模式下以标准品的浓度比上OD值绘制标准曲线,样本中的胎球蛋白A可直接从标准曲线上得到
 
试剂:准备与贮存
此试剂盒收到后立即贮存于2-8℃下,效期见试剂盒标签;所有成分在2-8℃下可保存至有效期
使用前,所有试剂平衡至室温,不同批次的试剂不能交换使用
 

  1. 包被板,96孔,包被了抗人胎球蛋白A抗体;微孔板固定于板架上,密封于含有干燥剂的铝箔密封袋内;贮存于2-8℃至有效期
  2. 胎球蛋白A示踪抗体,1瓶,0.6 ml,浓缩,HRP标记的抗人胎球蛋白A示踪抗体溶于稳定的蛋白基质中;此试剂使用前需用示踪剂抗体稀释液进行稀释;贮存于2-8℃至有效期
  3. 示踪抗体稀释液,1瓶,11ml,即用,Trizma盐酸溶于缓冲液;根据实验步骤用于示踪抗体稀释;贮存于2-8℃至有效期
  4. 试验缓冲液,浓缩,1瓶,11ml,含牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐;建议使用前以1:10比例用双蒸水稀释(如11 ml浓缩+99 ml的双蒸水);贮存于2-8℃至有效期
  5. 洗涤液,浓缩,1瓶,20ml,30倍浓缩;试验前需用580ml的双蒸水稀释,混匀;一旦稀释,不含叠氮化物防腐剂的磷酸缓冲盐洗涤液会含表面活性剂;稀释的洗涤液在室温下可保存至效期
  6. HRP底物液;1瓶,12ml,含过氧化氢的TMB底物液;贮存于2-8℃至有效期
  7. 终止液,1瓶,12ml,0.5M硫酸,贮存于2-8℃至有效期
  8. 胎球蛋白A标准品,5瓶,含胎球蛋白A,不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质;各标准品浓度见瓶子标签;3次冻存周期使用后,所有标准品保存至-20℃或更低
  9. 胎球蛋白A质控,2瓶,含人胎球蛋白A,不含叠氮化物防腐剂的液态牛血清基质,各质控的浓度范围见瓶子标签,3次冻存周期使用后质控保存至-20℃或更低

 
安全注意事项
 

  1. 此试剂用于临床参考实验室,仅供医生或实验室专业人士体外诊断用
  2. 若试剂是有潜在感染风险的,试验操作和处理时应戴手套
  3. 避免接触含TMB,过氧化氢,硫酸的试剂,TM,B会刺激皮肤和粘膜,导致皮肤过敏反应;TMB还可能是致癌物质;皮肤接触到硫酸会导致严重灼伤,不要接触到眼睛,皮肤,衣服,不要吸入烟雾,一旦接触,应立即用大量水冲洗至少15min
  4. 良好实验室操作规范

 
实验所需材料但试剂盒未提供
 

  1. 的单通道移液器,10-25-100-1000ul
  2. 适于100 ul的可重复用分液器
  3. 适于所有体积的一次性枪头
  4. 一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm
  5. 带盖的一次性塑料瓶;100-1000ml
  6. 铝箔纸
  7. 双蒸水或去离子水
  8. 塑料盖板或聚乙烯薄膜
  9. 多通道洗涤瓶或全自动(半自动)洗板系统
  10. 酶标仪,450nm

 
样本采集
人胎球蛋白A的检测所需血清或血浆样本量仅10 ul
个人在采样前无需特殊准备,全血采集,室温下立即凝集30min,然后离心分离出血清(850-1500 xg 10min)。全血采集3小时内需将血清从凝集中分离出来,转移至另一干净试管;血清样本可保存在-20℃或更低,避免超过三次的冻融
建议采用24小时尿液来检测尿液中的胎球蛋白A;采集第二天早晨的尿液,排除采样前刚进行剧烈运动的,因肾功能不全导致多尿的;由利尿药引起的人体内尿蛋白含量波动降低,可能与尿肌酸酐浓度相关;
细胞上清,组织提取物则需进行试验样本的倍比稀释;多个平行样检测得到更的试验结果
 
实验步骤
患者样本的准备
患者血清或血浆样本在检测前需用试验缓冲液进行1:10000 的稀释
 

  1. 以1A和1B 标记两个试管(12x75 mm)
  2. 加1ml的试验缓冲液至各试管(1A和1B)
  3. 加10 ul的患者血清至1A试管,混合(1:100)
  4. 从1A管内吸取10ul已稀释的样本至1B试管,混合(1:10000)

注意:建议采用/经校准的移液器,稀释过程小心操作,得到更的结果;建议采用多通道(Combitip)12.5ml的Eppendorf可重复移液器加1ml的试验缓冲液,而不用50ml的枪头
 
患者尿液样本的实验前用试验缓冲液1:100的稀释
 

  1. 以1标记一试管(12x75 mm)
  2. 各管加1ml试验缓冲液
  3. 加10ul患者尿液样本至1管,混合(1:100)

注意:若所得结果中样本浓度高于5个标准品中的zui高标准品浓度,则尿液样本需进一步稀释(如1:500),然后重新检测
 
试剂准备
 

  1. 试验前将所有试剂平衡至室温,不同批次的试剂不能混合使用
  2. 使用前,试验缓冲液(浓缩)及洗涤液(浓缩)需进行稀释,配制成工作液;详情请见“试剂”部分

 
试验操作
 

  1. 将实验所需板条固定于板架上,标准品,质控品及未知样本做双孔检测
  2. 试验布局

ROW STRIP 1 STRIP 2 STRIP 3
A STD 1 STD 5 SAMPLE 2
B STD 1 STD 5 SAMPLE 2
C STD 2 C 1 SAMPLE 3
D STD 2 C 1 SAMPLE 3
E STD 3 C 2  
F STD 3 C 2  
G STD 4 SAMPLE 1  
H STD 4 SAMPLE 1  

  1. 加25 ul的标准品,质控品及预稀释的1:10000样本至相应孔内;注意:尿液样本是1:100的稀释
  2. 每孔加100 ul的试验缓冲液
  3. 混匀,盖板,避免暴露于阳光下
  4. 室温下孵育2小时
  5. 示踪抗体工作液的准备,示踪抗体1:21的用示踪抗体稀释液稀释;每条板需1ml的示踪抗体稀释液+50 ul的胎球蛋白A示踪抗体
  6. 移去盖板,弃去孔内反应液,每孔加350ul的洗涤工作液洗板5次,然后彻底吸出孔内液体,或可采用全自动洗板机
  7. 以上稀释的示踪抗体工作液加100 ul至各孔
  8. 盖板,避免暴露于阳光下
  9. 室温下孵育30min
  10. 移去盖板,弃去孔内反应液,每孔加350ul的洗涤工作液洗板5次,然后彻底吸出孔内液体,或可采用全自动洗板机
  11. 每孔加100 ul的ELISA HRP 底物液
  12. 盖板,避免暴露于阳光下
  13. 室温下孵育20min
  14. 移去盖板,每孔加100 ul的终止液,混匀
  15. 10min 内在450nm酶标仪上检测吸收值

注意:为降低背景色,可以双波长检测,设置参考波长:595nm 或620 nm 或630nm
 
操作注意事项
 

  1. 建议所有标准品,质控品和未知样本做双孔检测;各双孔检测的吸收均值用于数据处理,结果计算
  2. 将光敏试剂保持装于原琥珀色瓶内
  3. 将剩余的包被板条放存在含干燥剂的密封袋内,避免受潮
  4. 操作严格,移液器经校准可确保试验的可重复性
  5. 孵育时间或温度也可能会影响试验结果
  6. 避免微孔内产生气泡,可能会导致结合率低,双孔读数变异系数高
  7. 使用前所有试剂都应彻底混匀,避免产生气泡

 
结果说明
 

  1. 计算各双孔吸收值均值
  2. 所有的吸收均值都减去标准品1(即0ng/ml)的吸收均值
  3. 在点对点或对数-对数坐标纸上以标准品的浓度为X轴,吸收均值为Y轴绘制标准曲线;或是采用数据处理软件进行结果计算

质控品和样本浓度(1:10000)可直接从标准曲线上读取,若采用的是对数-对数或数据处理软件计算则需用到对数转换;样本校正吸收值在浓度1ng/ml 和下一个zui高标准品间的需通过公式计算:

未知样本浓度=  未知样本吸收值   x   2nd 标准品浓度值
2nd 标准品吸光值
 
典型标准曲线
以下为典型示例的吸收值及标准曲线;此标准曲线不能用于其他实验的计算


期望值
70例正常成人血清检测人胎球蛋白A ,95%百分比的正常值范围在0.35-0.95 g/L,均值为0.57 g/L ;标准偏差为0.13 g/L
10000倍的稀释因子应考虑到样本浓度的zui终计算
如:从标准曲线上直接得到的10000倍稀释样本值是24.3 ng/mL,那原样本浓度为
24.3 ng/mL x 10,000 = 243000 ng/mL = 0.243 g/L
 
操作局限性
 

  1. 人胎球蛋白A直接检测的zui低浓度为5.0 ng/ml(试验分析灵敏度),10000倍稀释的样本血清回算后,原血清样本浓度的zui低检测限是50 ug/ml
  2. 因人胎球蛋白A检测无金标准,所以试验标准通过稀释含蛋白基质的高度纯化重组人胎球蛋白A建立
  3. 可直接读取的未知样本浓度高于350 ng/ml,建议对样本进一步稀释
  4. 若实验室酶标仪在450nm处的OD值不能超过2.0,建议将标准品6 舍去,不做检测
  5. 细菌或真菌污染的样本或试剂,或试剂间的交叉污染都可能会导致错误结果
  6. 聚酯树脂处理的去离子水不能激活过氧化氢酶

 
质量控制
适当的已知胎球蛋白A水平的质控可确保试验结果的有效性;建议所有实验室除了试剂盒本身的质控外,还应额外建立自己实验室的胎球蛋白A质控
 
性能指标
 

  1. 灵敏度

人胎球蛋白A分析灵敏度,零标准品20次重复试验,95%置信区间,zui后得5.0 ng/ml
 
 

  1. 线性

两个人的血清样本进行稀释检测,结果如下,ng/ml

# 稀释比例 检测值 期望值 回收率%
1 1:10,000 21.9    
  1:20,000 11.9 11.0 108
  1:40,000 5.3 5.5 96
  1:80,000 2.9 2.7 107
  1:160,000 1.6 1.4 114
2 1:10,000 192    
  1:20,000 99.9 96 104
  1:40,000 45.2 48 94
  1:80,000 22.2 24 93
  1:160,000 13.4 12 112
 
 

  1. 精密度

两个样本在一个试验中做20次重复检测,分析板内差异

 胎球蛋白A均值(ng/mL) CV (%)
33.6 5.5
121.1 4.8
 
两个样本双孔检测,做了12次检测,分析板间差异
胎球蛋白A均值(ng/mL) CV (%)
32.4 6.8
123.7 5.7
 
4. 回收率
两位患者血清加不同量的人胎球蛋白A ,检测,结果如下,ng/ml
# 原始值 加入的量 检测值 期望值 回收率%
1 33.6 21 25.1 27.3 92
    63 44.4 48.3 92
    200 120.1 116.8 103
2 121.1 21 68.9 71.1 97
    63 88.6 92.1 96
    200 157.1 160.6 98
 
 
 
 
 
本译文仅供参考,请以原说明书为准
中国*总代理:深圳市科润达生物工程有限公司
办公地址:深圳市南山区蛇口沿山路45号佳利泰大厦7D。
研发地址:深圳市南山区蛇口沿山路10号6楼
:(8线)传真:+86 755 26814431
免费订货:。
技术咨询:,;手机,;
:518067    kerunda@szonline.net
:www.kerunda.com.cn
欢迎索取详细资料,在线:kerunda_tech
 
 

地址:深圳市坪山区坑梓中兴路14号中城生命科学园A栋3层
联系人:科润达客服

深圳市科润达生物工程有限公司 版权所有  主营:TNF-α检测试剂盒|HMGB1多克隆抗体|糖代谢相关检测试剂|美国Invitrogen细胞因子

ICP备案号:粤ICP备18097826号 管理登陆 技术支持:化工仪器网   总流量:316367  网站地图

在线客服
在线客服
扫码关注我们
用心服务 成就你我